共抑制RAD18和REV1基因顯著增加順鉑對肺癌細胞的毒性

金君，李堅，袁榮霞

（江蘇大學附屬醫院呼吸內科，江蘇鎮江212001）

近年來全世界每年約有近1 600萬人死于肺癌［1］。大多數患者確診時已是局部晚期或晚期肺癌。順鉑作為晚期非小細胞肺癌聯合化療方案中的基本藥物，在臨床長期使用過程中引起的腫瘤細胞耐藥性使其治療效果逐漸降低［2］。順鉑主要通過作用于DNA導致其形成鏈間交聯和鏈內交聯，造成DNA損傷，由此干擾DNA的復制與轉錄過程，最終導致細胞死亡。鏈間交聯指DNA鏈間發生了錯誤的共價交聯，是毒性最強的一種DNA損傷，如不及時修復，鏈間交聯會轉換成DNA雙鏈斷裂（DSB）。相關研究發現，腫瘤細胞對順鉑的耐藥性與DNA損傷修復能力增強有關。根據DNA損傷的類型和位點，鏈間交聯損傷的修復方式可分為核苷酸切除修復、非同源末端連接、同源重組修復、跨損傷合成（translesion synthesis，TLS）修復和范可尼貧血（Fanconi anemia，FA）通路等［3］。而與其他通路不同的是，TLS通路可通過復制性DNA聚合酶越過損傷的DNA位點繼續進行DNA鏈復制來耐受DNA損傷［2－3］。

近年來的研究發現，肺癌細胞獲得性耐藥與FA通路以及TLS通路等的再活化有關［2－4］。在鏈間交聯損傷修復過程中，FA通路、TLS通路和其他信號通路交互作用，共同參與這種DNA損傷的修復。FA是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，絕大部分由FA相關基因失活引起。這種遺傳病會導致患者的體細胞對DNA交聯劑類化療藥物（如順鉑）異常敏感，并且使患者更易發生腫瘤和骨髓衰竭［5］。目前已經證實FA通路由19個FA蛋白（FANCA-FANCNT）組成，其中任何一個蛋白的缺失都有可能導致細胞對DNA交聯性損傷劑的高度敏感，這也構成了抑制FA通路蛋白增加鉑類藥物對腫瘤細胞毒性的作用機制［6］。

RAD18作為一種E3泛素連接酶可與RAD6結合形成RAD6／RAD18復合體，通過誘導增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的單泛素化和招募TLS聚合酶來激活TLS通路。RAD6／RAD18還可通過誘導FANCD2的單泛素化激活FA通路［7－8］。同時單泛素化的FANCD2亦可通過招募TLS聚合酶激活TLS通路。REV1屬于TLS聚合酶中的Y家族成員，在鏈間交聯和DSB損傷的修復中扮演了重要角色，具有為其他TLS聚合酶提供平臺的作用［9－10］。其他Y家族的DNA聚合酶通過REV1作用域與REV1相互作用，在DNA損傷耐受機制中行使功能。例如，DNA聚合酶η的一個PIP結構域與REV1作用域重疊，可與REV1結合并激活下游蛋白［11］。

本實驗應用siRNA技術沉默 A549／DDP細胞的FA通路和TLS通路的上游調節基因RAD18以及TLS通路的REV1基因后，觀察FANCD2及PCNA的單泛素化水平、細胞增殖率、細胞周期以及細胞凋亡率變化，探討抑制 RAD18和 REV1后逆轉 A549／DDP細胞對順鉑耐藥性的可行性及機制。

1　材料與方法

1.1　材料

肺癌A549和A549／DDP細胞株（中科院上海生命科學研究院）；RMPI 1640培養液以及胎牛血清（以色列Bioind公司）；順鉑注射液（江蘇豪森制藥有限公司）；siRNA套裝：含RAD18與REV1的特異性siRNA及陰性對照siRNA（廣州銳博生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invitrogen公司）；CCK-8檢測試劑盒（日本同仁化學研究所）；Annexin V-FITC／PI流式細胞凋亡檢測試劑盒與PI／RNase細胞周期檢測試劑（美國 BD公司）；RAD18和PCNA蛋白抗體（美國 Cell Signaling公司）；REV1和 FANCD2蛋白抗體（美國 Santa Cruz公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、PVDF膜、牛血清白蛋白和ECL發光劑（美國Millipore公司）。

1.2　細胞培養及siRNA轉染

用含有0.1%青霉素與鏈霉素（雙抗）及10%胎牛血清的RMPI 1640培養液培養A549和A549／DDP細胞株，在37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中孵育。

將處于對數生長期的A549／DDP細胞均勻接種于6孔板，使每孔密度相近，約為80%。過夜培養后用不含胎牛血清及雙抗的培養液（空白培養液）饑餓細胞2 h。取 siRNA儲存液2.5μL及 LipofectamineTM2000試劑5μL分別溶于250μL空白培養液中，室溫孵育5 min后，在20 min內加入每孔含空白培養液1 mL的上述6孔板中。轉染6～8 h后，用只含10%胎牛血清的培養液繼續培養，以備后續實驗使用。

1.3　蛋白質印跡法檢測肺癌細胞株中各蛋白的表達

提前1 d將A549和轉染前后的A549／DDP細胞株分別接種于6孔板中，待細胞處于對數生長期時，分別加入含順鉑濃度梯度為 0、1.25、2.5、5、10和20μg／mL的2 mL培養液培養24 h后，先用預冷（4℃）1×PBS沖洗各孔3次，棄上清液，再每孔加入細胞裂解液90μL，用細胞刮板分別取出細胞裂解物于標記的EP管中，干式恒溫器100℃煮沸5 min，細胞超聲破碎儀破碎30 s，常溫離心機2 000 r／min離心1 min后，置于－20℃冰箱保存。蛋白樣品行10%SDS-PAGE，根據蛋白分子量大小選擇轉膜90～120 min，后續用脫脂牛奶封閉1 h，相應的一抗REV1羊抗人（1∶1 000）、RAD18（1∶1 000）、FANCD2（1∶1 000）和 PCNA（1∶1 000）兔抗人低溫（4℃）搖床孵育過夜，用TBST洗膜（15 min×3次），羊抗鼠 IgG（1∶10 000）和羊抗兔 IgG（1∶10 000）二抗孵育1 h，現配現用ECL發光劑，用化學發光成像儀曝光，Lane 1D凝膠分析軟件分析其灰度。每個蛋白的相對含量為蛋白的表達量與對應的β-肌動蛋白比值，FANCD2單泛素化水平為FANCD2長短片段之比即L／S，PCNA單泛素化水平為PCNA－mUb與PCNA的比值。實驗重復3次。

1.4　CCK-8法檢測A549／DDP細胞的增殖率

將轉染前后的A549／DDP細胞株接種于96孔板，使每孔密度約為2×103個，同時設置3個復孔。在96孔板各孔中分別加入含順鉑濃度梯度為0、1.25、2.5、5、10和20μg／mL的 100μL培養基分別培養24和48 h，用空白培養液作為空白組進行校正。每孔加入含10%CCK-8試劑的培養液100 μL，培養箱孵育1～2 h后，酶標儀上檢測光密度（D）值。細胞增殖率＝［（實驗組D平均值－空白組D平均值）／（陰性對照組D平均值－空白組D平均值）］×100%。實驗重復3次。

1.5　流式細胞術檢測A549／DDP細胞的凋亡率

以6孔板培養轉染前后的A549／DDP細胞，使其密度約為2×105／孔。加入含順鉑濃度為10μg／mL的2 mL培養液培養48 h，用無EDTA胰蛋白酶消化細胞，低溫離心機2 000 r／min離心10 min，用預冷（4℃）1×PBS重懸細胞，再次離心，倒盡上清液，取1×連接緩沖液500 mL輕柔緩慢稀釋成細胞懸液，加入流式管中，順序加入5μL的Annexin VFITC和5μL的PI染色液同時輕搖混勻，室溫避光15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率（發射波長530 nm、激發波長488 nm）。實驗重復3次。

1.6　流式細胞術測細胞周期

6孔板培養轉染前后的A549／DDP細胞，使各孔密度約為2×105／孔。每孔用10μg／mL的2 mL培養液培養48 h后，用無EDTA的胰蛋白酶消化細胞，收集細胞于流式管中，用3 mL PBS重懸細胞，1 500 r／min離心10 min后，棄上清液，逐滴加入預冷的75%乙醇5 mL，混勻細胞，4℃避光過夜且超過18 h。低溫離心機1 500 r／min離心10 min，用1×PBS清洗細胞兩次，棄上清液，每管加入500μL PI／RNase染色液，過200目篩網后再加入標記好的流式管中，4℃避光保存，采用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.7　統計學處理

應用SPSS 22.0統計學軟件分析結果，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較行單因素方差分析，兩組均數比較行SNK-q檢驗，實驗組與對照組均數比較行Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。采用Bliss法計算肺癌細胞增殖的半數抑制濃度（50 percent inhibitory concentration，IC50）。

2　結果

2.1　A549和 A549／DDP細胞經順鉑處理后的RAD18、REV1蛋白表達水平

經不同濃度順鉑處理24 h后，A549細胞的RAD18蛋白和REV1蛋白表達水平隨著順鉑濃度的升高而下降；而A549／DDP細胞的RAD18、REV1蛋白表達隨著順鉑濃度升高而升高；在順鉑濃度為0時，A549／DDP細胞組 RAD18蛋白表達水平與A549細胞組無明顯差異（t＝1.739，P＝0.097），在其他的順鉑濃度點耐藥細胞中這兩個蛋白的表達量均明顯高于 A549細胞（均 P＜0.05）。A549／DDP細胞中RAD18和REV1蛋白的表達上調表明FA通路和TLS通路功能增強，提示與該細胞株對順鉑耐藥有關。見圖1和圖2。

圖1　A549和A549／DDP細胞經不同濃度順鉑處理后RAD18蛋白的表達水平

圖2　A549和A549／DDP細胞經不同濃度順鉑處理后REV1蛋白的表達

2.2　轉染 siRNA前后 A549／DDP細胞 REV1和RAD18蛋白的表達

A549／DDP細胞分別轉染 REV1-siRNA和RAD18-siRNA后，REV1蛋白和RAD18蛋白表達水平均比陰性對照組和空白對照組明顯降低（均P＜0.05）；陰性對照組與空白對照組組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3和圖4。表明REV1-siRNA和RAD18-siRNA轉染有效。

圖3　A549／DDP細胞轉染REV1-siRNA后REV1蛋白相對表達水平

圖4　A549／DDP細胞轉染RAD18-siRNA后RAD18蛋白相對表達水平

2.3　A549／DDP細胞轉染 RAD18-siRNA前后FANCD2單泛素化水平

蛋白質印跡結果顯示，轉染RAD18-siRNA后，經不同濃度順鉑處理24 h后的 A549／DDP細胞FANCD2蛋白單泛素化水平較轉染前明顯降低（均P＜0.05）（圖5），表明沉默 RAD18基因后抑制了FANCD2的單泛素化，RAD18位于FA通路的上游，是調控FA通路重要因子。

2.4　A549／DDP細胞轉染 RAD18-siRNA前后 PCNA單泛素化水平

轉染RAD18-siRNA后，經不同濃度順鉑處理24 h后A549／DDP細胞的PCNA單泛素化水平明顯降低（均 P＜0.05，圖6），表明 RAD18是參與 PCNA單泛素化調控的重要組分。RAD18和RAD6形成的RAD6／RAD18復合物可通過誘導PCNA單泛素化繼而激活TLS通路。沉默RAD18基因可使TLS通路的PCNA單泛素化水平明顯降低，表明RAD18不僅參與了FA通路的激活，也是TLS通路的調控因子。

圖5　A549／DDP細胞轉染RAD18-siRNA后FANCD2單泛素化水平

圖6　A549／DDP細胞轉染RAD18-siRNA后PCNA單泛素化水平

2.5　分別及共轉染RAD18-siRNA和REV1-siRNA對A549／DDP細胞順鉑敏感性的影響

2.5.1順鉑對轉染不同siRNAs的 A549／DDP細胞增殖的抑制作用 A549／DDP細胞分別和共轉染RAD18-siRNA和REV1-siRNA，經順鉑處理24 h和48 h后的IC50較未轉染細胞均明顯降低 （均P＜0.05），共轉染細胞的 IC50較單轉染 RAD18-siRNA或REV1-siRNA細胞進一步下降（均P＜0.05）。見表1。圖7和圖8顯示，隨著順鉑濃度的增高，單轉染組與共轉染組的細胞增殖率逐漸降低，且呈劑量依賴性，共轉染組的細胞增殖率下降較單轉染組更為明顯（均P＜0.05），而兩個單轉染組之間的細胞增殖率無明顯差異（P＞0.05）。隨著順鉑作用時間的增加，細胞增殖率繼續降低，呈現出時間依賴性。這些結果表明沉默RAD18和REV1基因可明顯增加順鉑耐藥肺癌細胞對順鉑的敏感性，這兩個基因共沉默則可進一步增強順鉑對A549／DDP細胞的細胞毒性。

表1　轉染不同siRNAs后A549／DDP細胞對順鉑的IC50 μg／mL

圖7　A549／DDP細胞轉染不同siRNAs后經順鉑處理24 h的增殖率

圖8　A549／DDP細胞轉染不同siRNAs后經順鉑處理48 h的增殖率

2.5.2轉染不同siRNAs后 A549／DDP細胞經順鉑誘導的凋亡率 流式細胞術檢測結果表明，A549／DDP細胞分別轉染RAD18-siRNA和REV1-siRNA以及兩者共轉染后，早期凋亡率分別為（24.60±2.11）%、（23.33±3.13）%和（40.55±1.01）%，均明顯高于未轉染細胞組的早期凋亡率 （12.62±1.75）% （均 P＜0.05）。兩個單轉染組之間的細胞早期凋亡率無明顯差異（t＝0.583，P＞0.05），但共轉染組細胞的早期凋亡率明顯高于兩個單轉染組（均 P＜0.05）。見圖9。

圖9　A549／DDP細胞轉染不同siRNAs后經10μg／m L順鉑處理48 h的凋亡率

2.5.3A549／DDP細胞轉染不同 siRNAs后順鉑誘導的細胞周期變化 分別和共轉染RAD18-siRNA以及 REV1-siRNA后，A549／DDP細胞經10μg／mL順鉑處理48 h，應用流式細胞儀檢測細胞周期，結果發現3個轉染組G2期細胞數比例較未轉染組明顯增加（均P＜0.05），且共轉染組比單轉染組增加更為明顯（均P＜0.05）。表明轉染RAD18-siRNA和（或）REV1-siRNA后，A549／DDP細胞主要阻滯于G2期。見圖10。

圖10　各組A549／DDP細胞經10μg／m L順鉑處理48 h的細胞周期

3　討論

順鉑主要是通過抑制DNA的復制殺傷腫瘤細胞，順鉑引起的DNA損傷類型包括鏈間交聯、DSBs、單鏈斷裂和染色體重排［12］。相關研究表明腫瘤細胞的DNA損傷修復能力是順鉑耐藥的主要原因之一，而順鉑耐藥是一個涉及多個DNA損傷修復通路的復雜過程［13］。因此，探明腫瘤細胞為了應對這些DNA損傷而具備的多種DNA修復機制是解決順鉑耐藥的前提。

腫瘤細胞通過DNA損傷反應機制不斷檢查染色體DNA是否存在受損或被阻滯的DNA復制叉。當細胞發生DNA交聯損傷時，可激活經典的FA通路產生修復反應，首先該通路的8個上游FA蛋白以及FA相關蛋白被活化形成FA核心復合物，然后單泛素化FANCD2和FANCI，再形成復合物ID，定位于受損的DNA，繼而募集并激活FA通路的下游蛋白到DNA損傷部位，經過與其他DNA修復通路蛋白的相互作用，修復損傷DNA［14］。有文獻報告，當細胞DNA交聯損傷發生時，除了FA核心復合物可以引起FANCD2的單泛素化，RAD18和RAD6形成的復合物也參與觸發FA通路的這一關鍵步驟［15］。FANCD2單泛素化是FA通路激活過程的中心環節，也是FA通路被激活的標志。FANCD2單泛素化水平反映了FA通路的激活狀態。研究顯示應用siRNA干擾技術直接下調FANCD2或者下調FA通路上游的蛋白表達，可以抑制FANCD2單泛素化，通過阻滯FA通路激活，抑制化療藥物誘導DNA損傷的修復，從而增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［16－18］。本研究應用 siRNA轉染技術敲減RAD18基因導致FANCD2的單泛素化水平明顯下降，并顯示出順鉑對耐藥肺癌細胞A549／DDP的細胞毒性明顯增強，順鉑誘導的細胞凋亡率明顯增加，以及細胞周期S／G2阻滯效應增強，證明RAD18作用于FA通路上游，直接參與調控和誘導FANCD2的單泛素化以及FA通路的激活，參與了DNA交聯損傷的修復。

DNA修復通路模型表明，致DNA損傷因子作用于細胞后導致DNA復制叉停滯、雙螺旋解開并產生異常的單鏈DNA。這些DNA單鏈未復制的區域被異常的單鏈DNA結合蛋白即復制蛋白A包被，繼而招募RAD18到DNA損傷位點，啟動TLS通路等參與的復制后修復［3］。RAD6與 RAD18結合后形成的RAD6／RAD18主要通過誘導PCNA單泛素化而激活TLS，促使特異性DNA聚合酶在DNA損傷部位募集，觸發 TLS通路的 DNA修復反應［19］。作為TLS聚合酶Y家族重要成員的REV1具有特殊的BRCT結構域，能與PCNA結合并發生相互作用［20］。亦有研究發現，FA核心復合物對REV1的募集也有調控效應，提示FA通路和TLS通路之間有著密切的相互作用［21］。本實驗沉默RAD18基因后顯示PCNA蛋白的單泛素化水平明顯下調，表明RAD18在TLS通路被激活的PCNA單泛素化過程中發揮了不可或缺的作用。

本次實驗證實，順鉑對A549／DDP細胞的毒性作用明顯低于A549細胞，而順鉑誘導的A549／DDP細胞REV1和RAD18蛋白表達水平明顯高于A549細胞，順鉑可誘導 A549／DDP細胞的 FANCD2和PCNA單泛素化水平呈劑量依賴性升高，提示FA通路與TLS通路均參與了A549／DDP細胞內順鉑誘導DNA交聯損傷的修復，或者說參與了A549／DDP細胞對順鉑的耐藥。應用siRNA轉染敲減RAD18基因下調其蛋白表達后可明顯抑制FANCD2和PCNA單泛素化水平，與此同時能顯著增強順鉑對A549／DDP的細胞毒性，表明RAD18在FA和TLS兩個通路參與的順鉑所致DNA損傷修復過程中發揮了作用［22］。此外，本研究中細胞增殖率和細胞凋亡實驗結果顯示，敲減REV1基因亦能明顯增加順鉑對A549／DDP細胞的殺傷效應，證實REV1在TLS通路參與的順鉑誘導的DNA交聯損傷修復中具有重要作用。值得注意的是，RAD18和REV1基因共沉默后增加順鉑對A549／DDP細胞毒性的作用強于分別單獨沉默RAD18和REV1基因，提示雖然RAD18在FA和TLS兩個通路中參與DNA修復過程，與REV1共同作用在TLS通路，但RAD18和REV1的DNA修復功能并不完全重疊在一個相同的DNA修復通路中。此外，RAD18或REV1亦可能通過FA和TLS通路之外的其他途徑或機制，參與DAN交聯損傷的修復，導致共沉默A549／DDP細胞的這兩個基因對順鉑的致敏效應強于單基因沉默。RAD18和REV1在DNA交聯損傷修復過程中可能存在的不同作用機制需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究顯示，FA通路和TLS通路在順鉑所致肺癌細胞DNA交聯損傷的修復中發揮了重要作用，這兩個通路功能上調是肺癌細胞對順鉑耐藥的主要機制之一。分別抑制這兩個通路中的RAD18和REV1蛋白均可增加順鉑對 A549／DDP細胞的細胞毒性，而共抑制RAD18和REV1可進一步增強順鉑對A549／DDP細胞的殺傷效應，顯示出對順鉑耐藥的逆轉效應。我們的研究結果為今后應用分子生物學技術或小分子抑制劑抑制RAD18和REV1，逆轉肺癌細胞對順鉑的耐藥性，提高肺癌化療效果提供了實驗依據。

［參考文獻］

［1］Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，etal.Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］.Int JCancer，2015，136（5）：E359.

［2］Jain A，Jahagirdar D，Nilendu P，et al.Molecular approaches to potentiate cisplatin responsiveness in carcinoma therapeutics［J］.Exp Rev Anticancer Ther，2017，17（9）：1－11.

［3］Haynes B，Saadat N，Myung B，et al.Crosstalk between translesion synthesis，Fanconi anemia network，and homologous recombination repair pathways in interstrand DNA crosslink repair and development of chemoresistance［J］.Mutat Res Rev Mutat Res，2015，763：258－266.

［4］Jiang HG，Chen P，Su JY，et al.Knockdown of REV3 synergizeswith ATR inhibition to promote apoptosis induced by cisplatin in lung cancer cells［J］.JCell Physiol，2017，232（12）：3433－3443.

［5］D′Andrea AD，Grompe M.The Fanconi anaemia／BRCA pathway［J］.Nat Rev Cancer，2003，3（1）：23－34.

［6］Ceccaldi R，Sarangi P，D′Andrea AD.The Fanconi anaemia pathway：new players and new functions［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2016，17（6）：337－349.

［7］Lehmann AR.Translesion synthesis in mammalian cells［J］.Exp Cell Res，2006，312（14）：2673－2676.

［8］Plosky BS，Vidal AE，Fernández de Henestrosa AR，et al.Controlling the subcellular localization of DNA polymerases iota and eta via interactions with ubiquitin［J］.EMBO J，2006，25（12）：2847－2855.

［9］Sharma S，Helchowski CM，Canman CE.The roles of DNA polymeraseζand the Y family DNA polymerases in promoting or preventing genome instability［J］.Mutat Res，2013（743／744）：97－110.

［10］Kanao R，MasutaniC.Regulation of DNA damage tolerance in mammalian cells by post-translationalmodifications of PCNA［J］.Mutat Res，2017（803／805）：82－88.

［11］Masuda Y，Kanao R，Kaji K，et al.Different types of interaction between PCNA and PIP boxes contribute to distinct cellular functions of Y-family DNA polymerases［J］.Nucleic Acids Res，2015，43（16）：7898－7910.

［12］Aguilera A，Gómez-González B.Genome instability：a mechanistic view of its causes and consequences［J］.Nat Rev Genet，2008，9（3）：204－217.

［13］Galluzzi L，Senovilla L，Vitale I，et al.Mechanisms of cisplatin resistance［J］.Oncogene，2012，31（15）：1869－1883.

［14］Liu T，Ghosal G，Yuan J，et al.FAN1 acts with FANCI-FANCD2 to promote DNA interstrand cross-link repair［J］.Science，2010，329（5992）：693－696.

［15］Park HK，Wang H，Zhang J，et al.Convergence of Rad6／Rad18 and Fanconi anemia tumor suppressor pathways upon DNA damage［J］.PLoS One，2010，5（10）：e13313.

［16］陳玉嬌，李堅，姜賀果，等.siRNA抑制FANCF基因增加肺癌細胞對順鉑的敏感性［J］.江蘇大學學報（醫學版），2014，24（3）：195－200.

［17］熊婷，陳小瓊，魏恒，等.PJ34對多發性骨髓瘤 RPMI8226細胞體外生長及其對馬法蘭敏感性的影響［J］.現代腫瘤醫學，2014，22（3）：489－493.

［18］陳康，李堅，李玫瑜.FAAP20和RAD51C基因敲減對肺癌細胞順鉑敏感性的影響［J］.江蘇大學學報（醫學版），2016，26（1）：5－10.

［19］Yang W，Woodgate R.What a difference a decade makes：insights into translesion DNA synthesis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（40）：15591－15598.

［20］Lim K，Lee MK，Duong PT，et al.Biophysical characterization of the interaction between FAAP20-UBZ4 domain and Rev1-BRCT domain［J］.FEBS Lett，2015，589（20 Pt B）：3037－3043.

［21］Kim H，D′Andrea AD.Regulation of DNA cross-link repair by the Fanconi anemia／BRCA pathway［J］.Gene Develop，2012，26（13）：1393－1408.

［22］Chen P，Li J，Chen YC，et al.The functional status of DNA repair pathways determines the sensitization effect to cisplatin in non-small cell lung cancer cells［J］.Cell Oncol，2016，39（6）：1－12.