人參皂苷Rg1改善小鼠肢體缺血后血管新生

王曉麗，金躍，劉鷺，張凱，楊乃全

（徐州醫科大學附屬淮安第二人民醫院1.檢驗科，2.心臟內科，江蘇淮安223002）

下肢動脈疾病（peripheral arterial disease，PAD）在2型糖尿病患者常見，常常是預后不好的標志［1－2］。有研究發現內皮型一氧化氮合酶（eNOS）功能受損在小鼠血管新生功能降低中發揮重要作用［3］。人參具有很高的醫用價值，目前已經從人參中分離鑒定出大量的活性成分，其中人參皂苷Rg1是發揮人參功效的主要成分［4］。近來大量的數據提示Rg1能夠促進血管新生以及人臍靜脈內皮細胞增殖、趨化、血管發生［5－8］。作為糖皮質激素受體的配體，Rg1能夠增加人臍靜脈內皮細胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）及 eNOS的活化［9］。這些研究均提示Rg1具有潛在的促進血管新生作用，也許可以作為一種新的治療下肢缺血的藥物。本研究通過制作小鼠后肢缺血模型，探討人參皂苷Rg1是否具有促進小鼠缺血后肢血管新生的作用以及可能的機制。

1　材料與方法

1.1　實驗分組

人參皂苷Rg1（純度＞96%）購于中國藥品生物制品檢定所。雄性C57BL／6J小鼠20只隨機分為兩組：對照組（n＝10）腹腔注射生理鹽水0.1 mL；Rg1治療組（n＝10）腹腔注射人參皂苷 Rg1（10 mg·kg－1）。每天給藥1次，連續2周。

1.2　后肢缺血模型的制作

所有小鼠以戊巴比妥（50 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后，在操作顯微鏡的輔助下在右側后肢自腹股溝韌帶中點至膝上做一個縱形長切口，顯露股動脈，小心地將股動脈與股靜脈和股神經分離，將股動脈自腹股溝韌帶處至膝上部分用7－0線結扎兩個結，切斷兩個結之間的股動脈。左側后肢作為非缺血對照。

1.3　激光多普勒灌注成像儀檢測小鼠后肢血流灌注

結扎股動脈后第14天，用激光多普勒灌注成像儀（PeriScan PIM 3，瑞典）測定小鼠后肢血流灌注恢復程度。以結扎側／未結扎側血流比值即LDPI指數比較不同組之間的差別［10］。

1.4　免疫熒光檢測缺血肢體毛細血管密度

在手術后2周，小鼠血流檢測后立即處死。收集每只小鼠缺血后肢的腓腸肌。腓腸肌包埋于OTC中，液氮速凍后制備成5μm冰凍組織切片。用免疫熒光染色法檢測毛細血管密度。每張玻片熒光顯微鏡（×200倍）隨機采集2～3個不同視野的圖像，用 Image-Pro Plus軟件（Media Cybernetics，Rockville，USA）分別計數每個視野中的CD31及DAPI染色陽性的區域。組織毛細血管密度以CD31陽性區域面積除以DAPI染色陽性區域面積的比值計算［10］。

1.5　比色法檢測缺血肢體一氧化氮分泌

手術后14 d，分離缺血肢體內收肌和半膜肌，并用PBS沖洗去除多余的血液，0.1 g肌肉放在2 mL PBS（pH＝7.4）中勻漿，勻漿物 5 000×g離心 5 min，提取上清液即刻檢測一氧化氮濃度（碧云天生物技術有限公司）［11］。

1.6　TUNEL法檢測缺血肌肉細胞凋亡

術后第14天，收集缺血肢體腓腸肌，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5μm切片。按照TUNEL試劑盒（In Situ Cell Death Detection kit，德國 Roche公司）說明書進行細胞凋亡檢測。

1.7　統計學分析

應用SPSS 22.0軟件包處理數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　Rg1治療改善缺血肢體血流

手術后14 d，激光多普勒檢測結果顯示，Rg1治療明顯地改善了小鼠缺血肢體的LDPI指數（0.65±0.11），而對照組為 0.43±0.08，兩者相比差異有統計學意義（t＝4.836，P＜0.05）。見圖1。

圖1　Rg1治療改善缺血肢體血流

2.2　Rg1治療增加缺血肢體毛細血管密度

免疫熒光定量檢測結果表明，Rg1治療組小鼠缺血肢體血管密度（CD31／DAPI比值）為0.65±0.11，與對照組（0.46±0.15）相比，Rg1治療使缺血肢體血管密度增加了0.4倍（t＝2.278，P＜0.05）。見圖2。

圖2　Rg1治療促進了缺血肢體毛細血管的新生

2.3　Rg1治療降低缺血肢體細胞凋亡

TUNEL法染色凋亡細胞核為綠色，正常細胞核為藍色。結果顯示，Rg1治療組小鼠缺血組織細胞的凋亡［（20.3±6.3）%］較對照組顯著降低［（30.7±6.4）%，t＝3.682，P＜0.05］。見圖3。

圖3　Rg1治療降低缺血組織細胞的凋亡

2.4　Rg1治療增加缺血肢體組織一氧化氮的分泌

Rg1治療組缺血肢體組織一氧化氮的含量為（239.4±98.2）μmol／mL，對照組為（139.5±68.6）μmol／mL，兩者相比差異有統計學意義（t＝2.637，P＜0.05）。

3　討論

本研究結果顯示，人參皂苷Rg1治療能顯著地改善小鼠肢體缺血后血流再灌注以及血管再生，其潛在機制可能為增加一氧化氮的分泌，抑制缺血組織細胞的凋亡。

既往的研究發現小鼠骨髓eNOS活化的下降會導致內皮祖細胞動員的受損［12］。有觀察提示NOS衍生的一氧化氮對適應急性嚴重的肢體缺血，避免發生組織壞死和維持動脈新生是必需的［13］。我們以前的研究表明人參皂苷Rg1提高了糖尿病小鼠及非糖尿病小鼠缺血肢體中磷酸化eNOS的表達［10］。所有這些研究表明，eNOS對促進缺血組織血管新生具有重要作用。

研究已經揭示，基本的細胞凋亡程序導致了不同形式的組織缺血后細胞丟失［14－15］，不受控制的細胞凋亡阻止了側支形成。我們的結果證實了人參皂苷Rg1治療能夠降低小鼠肢體缺血后細胞的凋亡。以前的研究發現Rg1治療能夠通過PI3K及Akt通路促進功能性血管的新生，而PI3K及Akt通路已經被證實在拮抗細胞凋亡中起作用［16－17］。PI3K及Akt通路是否參與了Rg1治療抑制肢體缺血后細胞凋亡還需要進一步的研究。

本研究的主要局限是我們僅選擇了人參皂苷Rg1一種劑量，不同的治療劑量對小鼠下肢缺血后血管新生的確切作用還需要進一步探討。

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