林木組培工廠化育苗中增殖培養優化技術探討

滕秀蘭，史紹林(.黑龍江省樺川縣林業局，黑龍江 佳木斯 54300；.黑龍江省森林與環境科學研究院，黑龍江 齊齊哈爾 6005)

自從組織培養技術應用到林木繁殖領域以來,已有部分樹種通過組培工廠化技術實現了大規模繁殖。但是大部分樹種仍然停留在實驗室階段，沒能實現產業化，其中最主要的原因在于增殖階段繁殖系數低，不能實現幾何式成倍的增長。林木組培工廠化生產是個系統工程，若要實現真正的工廠化生產，增殖階段的優化技術是重中之重。結合多個木本植物工廠化生產的經驗，探討增殖培養中的優化技術。

1 基本培養基優化

基本培養基提供植物組織生長的礦物質、碳水化合物。林木組培增殖培養中，基本培養基優化是最經常優化的內容。MS培養基是在被子植物門林木組織培養中最為常用的培養基。其具有較高的無機鹽濃度，常常在大多數樹種中應用。但是因為樹種不同MS培養基有很多地方需要調整，筆者在快速繁殖美國紅楓“秋焰”(Acer×freemanii)、“薩摩賽特”(Acerrubrum‘Somerset’)中增加硝酸銨、硫酸鹽含量改良MS培養基，發現改良MS對不定芽的增殖作用最明顯，增殖倍數顯著高于培養基MS、WPM和1/2MS等。然而在樺樹類增殖培養中，無機鹽含量較低的WPS或者1/3MS等培養基更有利于不定芽的增殖，如果增加無機鹽的含量很容易導致紫葉白樺(Betulapopulifolia‘Whitespire’× B.‘Crimson Frost’)、垂枝樺(BetulapendulaRoth)等樹種的玻璃化。我們在山新楊(Populusdavidiana×bolleana)組培工廠中利用1/2MS作為基本培養基，用微莖段扦插的方法提高增殖倍數3～4倍。培養基中Ca2 +濃度對于其試管苗的增殖生長也起到重要作用，其濃度增加可有效抑制玻璃化及莖尖壞死，因此也常常需要通過增添來優化。另外增殖培養的基本培養基優化時pH值的影響也應該是優化的范圍，而且往往容易忽略，大多數樹種培養基中pH值的范圍在5.8～6.2之間均可，但很多樹種需要優化，例如曹增強等[1]通過試驗發現適當的提高培養基pH值(6.0～6.5)會促進藍莓分支組培苗的分支，這樣可以大幅提高增殖倍數。培養基pH為7.0時，則會促進藍莓組培苗對Fe、Ca和B的吸收，因此需要在增殖培養時不斷調整，筆者發現在美國紅楓增殖培養時pH值在5.6時不定芽增殖最佳,增殖倍數平均可達3.19倍。

2 不同植物激素種類及配比優化

植物激素是在調控植物生長發育過程中具有十分重要且復雜的生理效應[2]。在林木快繁增殖培養中主要應用細胞分裂素和生長素調節優化不定芽的增殖培養，細胞分裂素過去常常用6-BA，KT、 ZT等。近年來TDZ和CPPU常常用在增殖培養中，CPPU是一種具有顯著生物活性的細胞分裂素，活性遠高于一般的嘌呤類細胞分裂素[3]，它還有獨特的優勢在于促進細胞分裂后持續的促進生長能力。TDZ作為一種有效的形態發生調節劑，其特點是通過單獨或與其他生長調節物質共同對植物細胞起作用，并具有相當高的活性[4]。植物組培中常用的生長素有IBA、.2,4-D和NAA等，增殖培養的優化過程中不但需要添加細胞分裂素和生長素絕對含量，而且要優化相對含量，由于植物激素添加含量極微，試驗設計添加常常是失之毫厘謬以千里。隨著生物統計學的發展與應用，近年來利用二次回歸旋轉設計等能夠較好的篩選植物激素的絕對含量和相對含量[5-6]。同時應該考慮連續多次增殖培養高濃度細胞分裂素的添加會導致組培苗玻璃化的危害。

3 最佳增殖時間和培養代數優化技術

在增殖過程中，不定芽的生長是個曲線生長過程，生長速度從啟動生長—快速生長—緩慢生長的過程，為了實現增殖培養高效的繁殖速度，需要培養過程中細致觀察，在最恰當的時間進行繼代培養。同時不定芽的來源往往是腋芽或間接的愈傷組織等，繼代培養代數太短往往繁殖效率低，繼代培養代數過長往往伴隨玻璃化危害、退化等情況的發生。

4 其他優化技術

其他優化技術主要包括：(1)優化接種數量，控制接種不定芽的密度。 在增殖優化過程中很多實踐者發現不定芽的密度也是需要優化的技術，這點往往被理論學者忽視，筆者發現為了充分利用培養基、光照和培養空間，在培養容器內“品”字形接種不定芽，根據每次接種樹種的不同和不定芽的大小調整接種數量。(2)優化培養基的注入量。由于不同的樹種在增殖階段生長速度有差異，增殖時間內消耗培養基的含量自然就會有差異，因此為了降低成本需要通過細致入微的觀察調整優化培養基的注入量，有時候也可以考慮重復使用培養基，筆者在山新楊增殖培養中曾試驗控制培養基的含量，取得了較好的效果。

參考文獻：

[1] 曹增強,徐瑩瑩,張寧.不同pH值對藍莓組培苗生長和元素吸收的影響[J].中國農業大學學報,2006,21(2):50-57

[2] Santner A,Calderon-Villalobos L I A,Estelle M . Plant horm ones are versatile chemical regulators of plant growth[J]. Nat Chem Biol,2009(5): 301-307

[3] 高金山,邊慶華．細胞分裂素CPPU的研究進展[J]．農藥,2006,45(3):151-153

[4] 徐曉峰,黃學林．TDZ:一種有效的植物生長調節劑[J]．植物學通報,2003,20(2):227-237

[5] 徐位力,羅煥亮,范恩友,等. 二次正交旋轉組合設計對馬占相思組培增殖培養基的優化[J]. 廣西植物,2002,22(6):517 -520

[6] 萬穎麗,王長偉,劉君.二次正交旋轉組合設計在文心蘭組培快繁技術中的應用[J]．2009(8):122-127