CRISPR/Cas9基因編輯技術應用現狀

□段瑩星

（河南師范大學生命科學學院 河南 新鄉 453007）

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術簡介

基因編輯技術已經發展更新了四代，分別是：ZFNS編輯技術、TALENS編輯技術、MGN編輯技術、CRISPR/Cas系統，本文著重介紹CRISPR/Cas9技術。21世紀初期，古細菌和真菌的對抗外來病毒的免疫方法被科學家在相關研究中發現，起主要作用的是細菌基因組的成簇規律重復間隔短回文序列(CRISPR)和能夠切割外源DNA片段的Cas蛋白。CRISPR/Cas9技術工作的原理是：CRISPR/Cas系統將病毒的基因整合到CRISPR的間隔序列中，記憶保存，當同種基因序列入侵時，可以實現快速準確特異切割。具體方法：外源基因組的三個保守核苷酸NGG（N可以為任何核苷酸）又稱為PAM(Protospacer adjacent motifs)基序，該基序可以被向導RNA(sgRNA)識別，sgRNA引導Cas9蛋白在PAM上游切割。斷鏈的DNA有兩種修復方式即非同源末端鏈接和同源末端鏈接，其中非同源末端連接的修復方式可以大大提升突變效率。由于CRISPR的向導RNA只需要20多個核苷酸序列就能識別到PAM基序，并且Cas9蛋白單聚體就能發揮作用，操作簡單方便，定位精準，所以CRISPR/Cas9基因編輯技術被廣泛應用在植物基因編輯中。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術的應用

2.1 改良農作物品質

利用CRISPR/Cas9技術在植物體內進行基因編輯的技術路線一共分為五步：（1）確定靶標基因組，選擇20bp的靶標序列連接PAM；（2）設計與靶序列配對的sgRNA序列；（3）把sgRNA和Cas蛋白連接起來；（4）通過農桿菌轉移法等方法轉入植物；（5）獲得轉基因植物。

多種模式植物、農作物和經濟作物已經通過CRISPR/Cas9基因編輯技術做到了基因改造，實現了農作物基因改良。例如：玉米的Zm IPK基因改造后植酸合成更合理；煙草Nt PDS基因改造后葉片黃化減輕；水稻Os SWEET1a等基因改造后，細菌性白葉枯病抗性增強；番茄Sl ANT1基因改造后，組織過表達花青素等。已公布研究表示，CRISPR/Cas9技術可以實現調控植物代謝過程、抗病性增強等，為開發更容易成活、經濟效益更高的農作物提供了有力的工具[1]。

2.2 在基因工程育種中的研究應用

實驗證明，磺酰脲類和苯達松類除草劑對水稻沒有作用，原因是水稻的bel基因對這兩類藥物有抗性。經過CRISPR/Cas9技術的敲除，構建特異性的sgRNA序列和Cas蛋白，突變株的性狀有所改善。其中，同源修復的純合突變株，表現為對磺酰脲類和苯達松類除草劑敏感。由于CRISPR/Cas9技術可以進行多基因位點編輯，所以其在多倍體上也有應用。例如玉米植酸，一旦不能被動物消化，經排泄就會對環境造成危害。科學家就針對玉米植酸合成的關鍵基因進行了敲除，并且獲得了不同突變率的突變體，為提供更適宜人類農業發展需要的植物物種提供了思路[2]。

2.3 植物基因功能研究中的應用

CRISPR/Cas9基因編輯技術提供了鑒定基因功能的思路。要知道某物種基因組中特定基因的功能，可以利用CRISPR/Cas9基因編輯技術把此物種基因組的靶基因敲掉（如上文所介紹的基因敲除）。對比觀察編輯前后植株的性狀及生理特點，可以達到估計基因功能的目的。此外，上文提到的編輯水稻bel基因，轉化方式是影響CRISPR/Cas9編輯效率的重要因素，使用基因槍法轉化sgRNA序列和Cas蛋白會獲得更高的突變效率，有助于多個基因的定點插入。單基因定點編輯，使用農桿菌轉化法效率更高。

結束語

CRISPR/Cas9基因編輯技術是新型生物技術的代表，自其發現以來，應用和研究在不斷地深化，在農作物品種改良、基因工程育種、基因工程育種中的研究辦法、植物基因功能的研究等多個領域都有了重要突破。從科學的角度看，通過基因編輯技術得到的轉基因植物可能不會帶來更高的健康風險或環境危害，但是怎么利用基因編輯技術是我們都應該思考的問題，也為監管工作帶來了更大挑戰。

[1]郝麗芬,等.CRISPER/Cas9基因編輯技術及在農作物品種改良研究中的應用[J].北方農業學報,2017,45(3)：29-35.

[2]姚祝平,等.CRISPER/Cas9基因編輯技術在植物基因工程育種中的應用[J].分子植物育種,2017,45,(7)：2647-2655.