高產β-苯乙醇黃酒酵母的選育

徐新彪 ，劉雙平 ，，4，鄒慧君 ，周志磊 ，3，韓　笑 ，5，姬中偉 ，3，毛　健 ，3，5

（1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室食品學院，江蘇無錫 214122； 2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000； 3.國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興 312000； 4.江蘇省產業技術研究院食品生物技術研究所（如皋江大食品生物技術研究所有限公司），江蘇南通 226500； 5.江南大學（如皋）食品生物技術研究所，江蘇南通 226500）

β-苯乙醇天然存在于玫瑰花、康乃馨等植物及精油中，是具有玫瑰花香的芳香醇，同時作為一種重要的香精香料成分，廣泛應用于食品、煙草和日化用品中[1-2]。β-苯乙醇在發酵酒中廣泛存在，在啤酒中含量為15～20 mg/L；在清酒中含量為40～60 mg/L，在黃酒中含量可以達到100 mg/L左右，雖然濃度已經較高，但是進一步提高β-苯乙醇含量有利于提升黃酒風味[3-4]。β-苯乙醇是黃酒中重要的芳香化合物，賦予黃酒優雅的香氣，在黃酒國標GB/T 13662—2008中，對不同類型黃酒中β-苯乙醇最低含量有要求[5]。

黃酒中β-苯乙醇主要由黃酒酵母（釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）代謝產生，黃酒酵母合成β-苯乙醇主要有Ehrlich途徑和從頭合成途徑（見圖1），其中有兩個關鍵反饋抑制，DAHP合成酶分別受到L-苯丙氨酸和酪氨酸的反饋抑制。在含有一定濃度L-苯丙氨酸結構類似物即對氟苯丙氨酸（PFP）的篩選培養基上，低產DAHP合成酶的菌株容易被殺死或抑制生長，經誘變后產酶量高的菌株可以先與底物類似物結合以消除其抑制作用，從而篩選出高產β-苯乙醇的正突變菌株[6-7]。雖然目前基因工程技術已成熟運用于微生物優良性狀定向改造，但是基因工程菌株在傳統發酵黃酒中應用仍存在爭議與市場風險，為避免此問題，本研究選用傳統紫外誘變結合底物類似物抗性選育，所選育出的黃酒酵母完全可以在黃酒發酵工業中應用。

圖1　釀酒酵母β-苯乙醇合成途徑

釀酒酵母作為雙倍體菌株，誘變后正突變菌株可能會存在遺傳不穩定的問題，雙倍體營養體可以通過產生子囊孢子生成單倍體孢子，而在HO基因未敲除的情況下單倍體自身會轉化為雙倍體。

目前釀酒酵母發酵法提高β-苯乙醇產量分為兩類，一類是選育釀酒酵母并在發酵體系中外源添加前體化合物L-苯丙氨酸，通過Ehrlich途徑提高β-苯乙醇產量，如崔志峰等紫外誘變獲得了1株在L-苯丙氨酸為5 g/L的發酵培養基中β-苯乙醇產量為3.6 g/L，比出發菌株提高了9.1%的菌株，以及黃筱萍等篩選出1株在L-苯丙氨酸含量為8 g/L的發酵體系下，β-苯乙醇質量濃度達4.3l g/L的釀酒酵母菌株,但是在發酵工業中外源添加氨基酸的成本較高；另一類是選育的釀酒酵母直接利用碳源從頭合成β-苯乙醇，如李記明等報道釀酒酵母在干紅葡萄酒中產量達169.38 mg/L，但是并未對酒精發酵能力做具體報道[8-10]。由于β-苯乙醇對酵母的脅迫能力高于乙醇，高產β-苯乙醇釀酒酵母產乙醇能力通常會有降低，所以在不外源添加前體化合物下，選育高產β-苯乙醇并且酒精發酵性能優良的釀酒酵母在釀造工業中具有較高應用價值。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

1.1.1　菌株與主要試劑

釀酒酵母出發菌株Y1615：資源平臺號S.cerevisiaeRWBL Y1615 ZC，從紹興地區酒廠篩選并在實驗室菌種庫保藏；對氟苯丙氨酸（PFP）：上海百靈威公司；無氨基酵母氮源（YNB）培養基：美國BD公司。

1.1.2　主要儀器

e2695高效液相色譜系統(配有2489UV/Vis Detector檢測器)，美國沃特世公司；5805CL臺式高速冷凍離心機，德國艾本德公司；Thermo Micro CL17高速離心機，美國賽默飛世爾科技公司；紫外可見分光光度計，優尼柯（上海）儀器有限公司；CX31RTSF顯微鏡，日本OLYMPUS公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；恒溫搖床，上海合恒儀器設備有限公司。

1.2　培養基

YPD培養基：酵母提取物10 g/L、魚粉蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。

YNBP培養基：6.7 g/L的YNB、20 g/L的葡萄糖，瓊脂粉20 g/L，額外的分別加入0、0.04 g/L、0.05 g/L、0.06 g/L、0.07 g/L、0.08 g/L、0.09 g/L、0.1 g/L的對氟苯丙氨酸（PFP）。

酒精篩選培養基：YPD液體培養基額外加入10%vol乙醇。

McClary生孢培養基：葡萄糖1 g/L，KCl 1.8 g/L，NaAc 8.2 g/L，酵母提取物2.5 g/L，瓊脂20 g/L。

黃酒模擬液篩選培養基：1 kg蒸熟米飯（含水率為70%）中加入水1 L、麥曲0.05 kg，攪拌均勻，60℃保溫8 h，以4500 r/min離心5 min，取上清液以115℃滅菌15 min。

黃酒發酵培養基：蒸熟米飯（含水率為70%）50%，水40%，酒母5%，麥曲5%，攪拌均勻。

1.3　實驗方法

1.3.1　出發菌株生長曲線的確定

取200 μL甘油保藏釀酒酵母Y1615涂布YPD平板純化，再經YPD平板和YPD搖瓶傳代復壯。

取5mL菌液接種100mLYPD搖瓶，以200r/min、30℃培養，每隔1 h測定OD600，確定出發菌株指數增長中期時間即是紫外誘變開始時間，做3個平行。

1.3.2　紫外照射時間的確定

按1.3.1方法獲得指數增長中期的誘變出發菌株菌液，取10 mL菌液以6000 r/min離心5 min，棄上清液，無菌生理鹽水洗滌后加50 mL無菌生理鹽水得菌懸液。

紫外燈開20 min以穩定光波，取5 mL上述菌懸液到無菌培養皿中，培養皿中加入滅菌大頭針。培養皿置于磁力攪拌器上，垂直放置于紫外燈（15 W）以下20 cm處，黑暗條件下打開皿蓋，照射時間為40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s。

照射完畢后，在紅光燈下或者黑暗條件下，將誘變后菌懸液以10倍稀釋法稀釋4次，未經紫外照射的菌懸液以10倍稀釋法稀釋5次，各取200 μL稀釋液涂布YPD平板，用錫紙包好，30℃倒置培養48 h，每組3個平行。

觀察記錄平板菌落數，計算致死率，繪制紫外照射致死率曲線，確定致死率為90%～100%的紫外照射時間。致死率=(對照菌落數-誘變菌落數)/對照菌落數。

1.3.3　PFP對出發菌株最低全致死濃度確定

如1.3.1獲得出發菌株菌懸液，用10倍稀釋法稀釋4次，分別涂布200 μL到不同PFP濃度的YNBP平板上，每個梯度做3個平行。

30℃培養2～3 d，記錄菌落數后繪制PFP對出發菌株致死率曲線。

1.3.4　紫外誘變與PFP抗性、酒精耐受性篩選

如1.3.2中步驟獲得紫外誘變出發菌株并對其進行紫外照射，照射時間為140 s。取紫外誘變后菌懸液200 μL涂布到PFP濃度為0.12 g/L的YNBP平板，用錫紙包好以避光，10倍稀釋法每個稀釋梯度下3個平板，30℃培養72 h。

酒精耐受性篩選：挑取PFP抗性篩選后突變菌株，先在96孔板的YPD液體培養基上擴培，再接入96孔板的酒精篩選培養基，每株菌株接種量為5%，30℃培養，分別在12 h和24 h用酶標儀測定OD600并篩選OD600數值相對較高的突變菌株。

1.3.5　黃酒模擬液發酵篩選

對氟苯丙氨酸抗性、酒精耐受性篩選后菌株經YPD平板和YPD搖瓶復壯擴培，按5%接種量接到50 mL黃酒模擬液，30℃靜置發酵7 d，每株菌做3個平行。高效液相色譜法測定黃酒模擬液中β-苯乙醇含量，篩選β-苯乙醇含量相對較高的菌株。

1.3.6　雙倍體正菌株生孢純化

對數生長中期正突變菌株用生理鹽水重懸，菌懸液適度稀釋后涂布于McClary生孢培養基，30℃培養1～2 d。單菌落劃線到生孢培養基上，30℃培養5～7 d，每隔24 h取樣用石炭酸復紅染色法觀察產孢情況，每次取3個視野，計算生孢率，生孢率達到90%時進行下一步實驗。

滅活雙倍體營養體：用pH7的磷酸鈉緩沖液洗滌含有子囊孢子和部分雙倍體菌體，65℃水浴加熱10 min，取樣涂布YPD平板以驗證雙倍體營養菌株是否完全滅活。

取滅活后菌液離心收集沉淀，加入1 mL的1.5%蝸牛酶和無菌玻璃珠，28℃下振蕩0.5～1 h，酶解子囊壁使單倍體分離。以5000 r/min離心5 min收集菌體，磷酸鈉緩沖液洗滌后混懸，梯度稀釋至10-1到10-5，每梯度取100 μL涂布YPD平板，30℃下培養1～2 d。

黃酒發酵篩選：取YPD平板上菌落較大的菌株進行黃酒發酵實驗，篩選正突變基因可穩定遺傳的純合雙倍體菌株。黃酒前發酵5 d，后發酵15 d，結束后測定苯乙醇含量及其他理化指標。

1.3.7　菌株傳代穩定性實驗

將所篩選的生孢純化后純合雙倍體菌株在YPD培養基上傳代培養5代，每代進行黃酒發酵，測定β-苯乙醇含量及酒精產量。

1.3.8　高效液相色譜條件

取2 mL樣品12000 r/min離心1 min，取上清液1 mL過0.22 μm水系膜。XbridgeTM Amide 5μm(4.6×0.25 mm)色譜柱，流動相為甲醇∶水=1∶1，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2　結果與分析

2.1　野生菌株生長曲線和紫外照射致死率曲線（圖2、圖3）

圖2　出發菌株生長曲線

由圖2可知，野生酵母菌株200 r/min培養3 h后酵母OD600值明顯升高，酵母繁殖進入指數生長期，培養4 h時野生酵母菌株處于指數生長中期，因此以200 r/min培養4 h的酵母菌液作為誘變出發菌株進行紫外誘變。

圖3　紫外照射致死率曲線

由圖3可知，隨著紫外照射時間的增加，誘變出發菌株的致死率不斷增加，一般認為致死率達到90%左右可篩選到變異幅度較大的正突變菌株[12]。照射時間為140 s時，致死率為90%以上，因此選擇紫外照射140 s作為紫外誘變照射時間。

2.2　對氟苯丙氨酸致死率曲線（圖4）

據Rafael報道，培養基中對氟苯丙氨酸濃度為5 mmol/L所篩選面包酵母的最低全部致死濃度[13]。據Akita報道，在含有0.5 mg/mL對氟苯丙氨酸的培養基中，正突變菌株分離效率為2.2×10-7，正突變菌株苯乙醇產量是野生菌株的12倍，達479 mg/L，因此選擇合適的底物類似物及合適篩選濃度對篩選效果至關重要[14]。

圖4　對氟苯丙氨酸對出發菌株致死率曲線

如圖4所示，將出發菌株涂布到PFP濃度為0.09 g/L的YNBP平板，幾乎沒有酵母菌株生長。紫外誘變后正突變菌株在0.09 g/L的YNBP平板上生長，為了保證篩選到高產β-苯乙醇的正突變菌株，將紫外誘變后菌懸液涂布到PFP濃度為0.2 g/L的YNBP平板。

表1　突變菌株酒精耐受性篩選

2.3　紫外誘變與對氟苯丙氨酸抗性、酒精耐受性篩選

紫外誘變后的菌懸液涂布到YPD平板，經對氟苯丙氨酸抗性篩選到526株菌株，在96孔板上酒精耐受性篩選，12 h和24 h時OD600數值相對較高的51株突變菌株，結果如表1所示，將51株突變菌株用于下一步黃酒模擬液篩選。

2.4　黃酒模擬液發酵篩選

將對氟苯丙氨酸抗性、酒精耐受性篩選后51株菌株經黃酒模擬液發酵后測定β-苯乙醇含量。為提高篩選效率及保證篩選培養基的一致性，選用黃酒模擬液作為篩選培養基，以β-苯乙醇產量和酒精產量為篩選指標（圖5）。如圖5所示，1-E4、4-C7、5-F5正突變菌株β-苯乙醇產量明顯高于出發菌株，其中5-F5菌株β-苯乙醇產量為237.16 mg/L，3株菌株酒精發酵能力未受明顯影響，釀酒酵母仍可良好進行酒精發酵，因此選擇β-苯乙醇產量較高的5-F5正突變菌株進行下一步生孢純化實驗。

2.5　雙倍體正菌株生孢純化（圖6、圖7）

本研究對紫外誘變后雙倍體菌株進行產孢處理，雙倍體細胞中同源染色體中突變基因會轉到單倍體孢子中，單倍體孢子再經培養后成純合雙倍體菌株，正突變基因得以穩定遺傳，正突變菌株遺傳穩定性增強。

將正突變菌株5-F5產孢處理，圖6為子囊孢子和部分二倍體營養體形態。在平板上挑選菌落形態較大的8株菌株在黃酒發酵培養基中進行黃酒發酵實驗。為探究正突變菌株在黃酒雙邊發酵和復雜微生物環境中的β-苯乙醇產量和酒精發酵特性，相比于黃酒模擬液篩選培養基在黃酒發酵培養基中添加麥曲，也因此正突變菌株在兩種發酵體系下β-苯乙醇產量和酒精產量略顯不同。黃酒發酵結果顯示BYC-3菌株的β-苯乙醇產量是出發釀酒酵母的2.67倍，達到238.12 mg/L，產酒精能力均達到16%vol以上，酒精發酵性能與出發菌株相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.6　菌株傳代穩定性實驗（表2）

將BYC-3菌株在YPD培養基上傳代培養5次，每代酵母菌株作為酒母進行黃酒發酵檢測β-苯乙醇和酒精含量變化，結果表明，傳代后菌株的酒精產量沒有顯著性差異（p＞0.05），β-苯乙醇產量穩定，沒有顯著下降（p＞0.05），這為BYC-3菌株在工業中穩定生產奠定了基礎。

3　結論

圖5　突變菌株發酵模擬液中β-苯乙醇和酒精含量

圖6　正突變菌株子囊孢子和部分二倍體營養體顯微圖

圖7　產孢純化后雙倍體菌株β-苯乙醇和酒精產量

本研究以實驗室保藏菌株S.cerevisiaeRWBL Y1615 ZC為誘變出發菌株，由于菌株用于黃酒釀造工業，選用安全有效的紫外誘變，再進行底物類似物即對氟苯丙氨酸抗性篩選，紫外照射誘變時間為140 s，對氟苯丙氨酸對出發菌株的最低全致死濃度為0.09 g/L，為保證篩選效果以含有0.2 g/L對氟苯丙氨酸的YNBP平板為篩選平板，將篩選的526株菌株進行酒精耐受性篩選，最后將51株菌株進行黃酒模擬液篩選，得到β-苯乙醇產量明顯提高的3株正突變菌株；再將其中β-苯乙醇最高的正突變菌株5-F5進行產孢純化和篩選，正突變菌株遺傳穩定性得以增強，正突變菌株BYC-3菌株β-苯乙醇產量達238.12 mg/L，是出發菌株的2.67倍，并且產酒精性能和出發菌株相比無顯著性差異，菌株傳代穩定性好。

表2　傳代穩定性實驗酒精和β-苯乙醇產量

本研究在不外源添加前體化合物情況下，篩選得到高產風味物質β-苯乙醇且酒精發酵性能優良黃酒酵母BYC-3，對于發酵法提升黃酒風味有重要意義，在釀酒工業特別是黃酒釀造工業中具有較高應用價值。

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