細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究進展

徐夢飛，盧平萍，馬　勛，張艷艷，王煒燁,，孟季蒙，王正榮*，薄新文*

(1. 省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室/新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，石河子 832000；2. 石河子大學動物科技學院，石河子 832000)

細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，E.g)，系帶科、棘球屬絳蟲，其擁有復雜的生活史，包括蟲卵、六鉤蚴、棘球蚴、成蟲等4個發育階段，以及兩任宿主[1]。其成蟲主要寄生于犬科食肉動物，如犬、狼等(終末宿主)，幼蟲寄生于牛、羊等食草動物和人(中間宿主)。包蟲病是由細粒棘球絳蟲的幼蟲引起的重要人畜共患病，對人類的健康和養殖業的發展構成嚴重的威脅，并且其分布相當廣泛[2]，在亞洲、歐洲、非洲、北美洲的高原及氣候寒冷的牧區與半牧區較為流行，被WHO列為嚴重的“被忽視的熱帶病”[3-5]。中國是包蟲病流行較為嚴重的國家之一，主要在西部的牧區和半牧區，其中20多個省、自治區和直轄市都已證實有包蟲病感染的病例，主要流行于四川西部、甘肅、內蒙、寧夏、青海、西藏和新疆，在2012年被列為《國家中長期動物疫病防治規劃(2012—2020年)》優先防治的國內動物疫病[6]。

在早期預防階段，除在包蟲病流行區進行健康教育之外，疫苗預防是主要的預防方法。近些年，在包蟲病研究中，主要包括疫苗候選分子、藥物靶點和診斷標志物的篩選，而了解細粒棘球絳蟲蛋白構成情況是以上工作的基礎和前提，蛋白質組學是從整體水平對細粒棘球蚴的蛋白質進行大規模研究和探索，為包蟲病的預防和治療探索新的方法和思路[2]。下面將從相關的研究方法和進展等方面進行闡述。

1　細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究的主要技術和手段

目前蛋白質組學研究的內容包括三個方面，即蛋白質分離、鑒定和生物信息學分析，其中蛋白質分離和鑒定的核心技術是雙向凝膠電泳和質譜技術，而生物信息學分析必須先建立蛋白質數據庫，后進行蛋白質預測及功能分析等操作。下面將從以上三個方面進行概述。

1.1　雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳(2-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是當前用于分離組織、細胞蛋白質最有效的分離手段[7]，其能夠同時將數千種蛋白質分離和展示。2-DE結合了等電聚焦技術和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術。通常第一維電泳是等電聚焦電泳，根據蛋白質等電點不同將其分離，第二維電泳是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據相對分子質量對蛋白質進行分離[3]。這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。

由于雙向電泳具有很高的分辨率，在細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究中應用廣泛，同時也在不斷改進，李居怡等在分析細粒棘球蚴囊液過程中，通過比較等電聚焦中膠條的pH值發現，pH值在7～10時分離蛋白質效果更好，得到的單個蛋白質斑點更多[7]。通常2-DE技術會串聯質譜(mass spectrometry, MS)技術使用，從而進行差異蛋白質組學分析，其中基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flying mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)可實現2-DE分離后蛋白質的快速、靈敏和高通量鑒定[8]。但該技術重復性差，并且某些疏水蛋白不適合進行等電點聚焦電泳，檢測不出低豐度蛋白質等[3]。

1.2　質譜技術

質譜技術已廣泛應用于E.g蛋白質組學研究, 它的基本原理是樣品分子離子化后, 根據不同離子間的質荷比(m/z)的差異來分離樣品并確定相對分子質量, 進行成分和結構分析[9]。常用的質譜技術有MALDI-TOF-MS和電噴霧離子化串聯質譜分析法(electrical spray ionisation-mass spectrometer/mass spectrometer, ESI-MS/MS)，前者最適于肽相對分子質量分析，具有易于操作、分辨率高和靈敏度高的特點，后者最適于測定肽序列分析。利用生物信息學對這些蛋白質組學技術獲得的數據庫進行分析, 在篩選生物標志物領域有著重要的作用。

1.3　生物信息學分析

質譜技術測定的結果通過高通量質譜軟件分析、蛋白質數據庫比對及生物信息學分析來鑒定蛋白質。現有的較成熟的蛋白質搜索數據庫有EMBL、SWISS-PROT及NCBI的非冗余蛋白質序列數據庫，其中SWISS-PROT是目前世界上最大、蛋白質種類最多的蛋白質組數據庫[10]。在細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究中，生物信息學分析起著重要的作用，為2-DE、MS等技術獲得數據進行高通量的分析，從而得出詳細的結果，通過數據庫比對，還能進行基因功能聚類、通路富集等分析，為細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究提供了巨大的幫助。

1.4　近幾年細粒棘球絳蟲蛋白質組學常用方法

隨著技術的進步，細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究中用到的技術和手段也隨之提高，在常用的2-DE、MS和生物信息學分析的基礎上，近幾年在細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究的方法和手段上也出現了新的嘗試，例如，基質輔助激光解吸附四級桿飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry, MALDI-Q-TOF MS)[11]、液相色譜-二級質譜連用(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)[12]、強陽離子交換(strong cation exchange, SCX)、雙向液相色譜-質譜聯用(2-dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry, 2DLC-MS)[13]、免疫印跡(immunoblot)[14]、矩陣輔助激光解吸/電離串聯時間質譜法(matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF-MS)[15]、電感耦合等離子體原子發射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer, ICP-AES)[16]、基質輔助激光解吸附四級桿飛行時間質譜-二級質譜聯用(matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry/mass spectrometry, MALDI-Q-TOF MS/MS)、電噴霧液質聯用四級桿飛行時間質譜-二級質譜聯用(liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry/mass spectrometry, LC-ESI-Q-TOF MS/MS)[17]、激光顯微切割(laser microdissection, LMD)[18]，并且相關數據庫完善和分析軟件的發展，使蛋白質組學研究得到了快速發展。

2　細粒棘球絳蟲蛋白質組學研究

2013年，具有轉折性和革命性的兩篇關于細粒棘球絳蟲基因組研究論文發表，I. J. Tsai等描述了E.g的基因組草圖[19]，H. J. Zheng等報道了E.g的基因組的序列與分析[20]，這兩項研究成果，為人們在細粒棘球絳蟲的生物學、變異、發育、進化、致病機制和與宿主之間的相互作用等方面提供了新的研究方向，其中之一便是蛋白質組學。

E.g發育的全程包括蟲卵、六鉤蚴、棘球蚴、原頭蚴和成蟲等5個主要形態階段。其中在中間宿主體內主要為棘球蚴階段，即包囊階段，在終末宿主體內主要是成蟲階段。目前E.g的整體蛋白質組學研究主要集中在棘球蚴階段和成蟲階段，其他階段由于樣本獲得和操作的困難性，目前鮮有相應的研究。

2.1　棘球蚴蛋白質組學

此階段為包囊形態，包囊內充滿液體，由包囊壁包裹，包囊液中含有原頭蚴。當前對棘球蚴蛋白質組的研究主要見于三個部分，即生發層(germinal layer, GL)、包囊液(hydatid cyst fluid, HCF)和原頭蚴(protoscolex, PSC)。此階段也是寄生蟲與宿主之間相互作用最活躍的時期，特別是對于ES產物的研究，對于疫苗研發和臨床診斷的標志物的研究具有重要的意義。

包囊壁包含有內外兩層，即外層的薄片層(laminated layer, LL)與內層的GL。LL為非細胞結構，由GL衍生而成的薄層，主要作用是保護包囊不受宿主細胞的直接攻擊；GL是由細胞形成的合胞體層，GL是產生PSC的部位，同時也是棘球蚴與宿主之間相互作用的部位，在棘球蚴生存過程中有著重要的作用，如攝取營養物質、分泌排泄以及免疫逃避等[21-23]。GL能夠控制寄生蟲從宿主獲取特定的氨基酸、蛋白質及營養物質，例如由于處于中絳期的E.g缺乏合成脂肪和膽固醇的能力，E.g通過使用脂肪酸結合蛋白(FABP)以及載脂蛋白B抗原從宿主那里獲得必需的脂肪[19]。K. M. Monteiro等[24]對GL進行蛋白質組學分析后，鑒別出25個E.g蛋白質，通過功能分析后，發現大部分蛋白質與代謝、產能和轉化有關，這種結果也符合GL具有生殖功能的特征，并且可以推測出這些蛋白質都很活躍。棘球蚴是E.g在中間宿主體內的主要存在形式，作為抗原而引起宿主的免疫應答，而棘球蚴為能夠在中間宿主體內發育、增殖并長期存活，通過某些途徑逃避宿主的免疫效應，在進化過程中獲得了某些自我保護的能力——免疫逃避[25]。作為棘球蚴與宿主重要的接觸面——GL在棘球蚴免疫逃避過程中發揮著重要的作用，GL與LL構成的包囊壁作為免疫逃避的有效屏障，將宿主與包囊內的寄生蟲隔離，保證寄生蟲的存活；其次，棘球蚴可通過胞吞作用攝取宿主的蛋白質，并將其分泌在GL表面，進行免疫逃避，降低炎癥反應[12，24]，并且棘球蚴能夠通過自身表達和綿羊宿主的某些相似的抗原，從而進行免疫逃避[26]。另外，GL中包含有多種可對宿主免疫應答進行抑制或直接破壞的蛋白質，如AgB8/1作為EgAgB基因家族的蛋白質產物，能夠干擾并改變宿主的免疫反應[26]；副肌球蛋白是具有多種功能的宿主免疫調節蛋白，通過與補體、免疫球蛋白和細胞免疫分子發揮免疫調節作用；四分子交聯體家族成員9能與各種細胞表面分子作用，如主要組織相容性復合體、Fc受體，從而調節它們的功能或信號，通過作為宿主配體的受體對宿主免疫功能進行調節；AgB和EgTeg能夠誘發和維持Th2極化的微環境，營造棘球蚴適宜的生存環境有助于建立起E.g的慢性感染；E.g硫氧還過氧化物酶(E.gthioredoxin peroxidase, EgTPx)能夠抵抗宿主的氧化作用，增加寄生蟲的生存概率；Ag5包含有一個高保守性的黏多糖結合的機構域，能夠以此為抗原，并且以Ag5為抗原的疫苗已經上市，但其生物學意義并未完全研究透徹[24]。

HCF是由包囊壁包裹的無色清亮的液體，其中含有大量的蛋白質，其中主要包括兩類，即GL和PSC的ES產物，以及大量宿主的蛋白質[24]，本文將HCF中的蛋白質按功能分為三類，即PSC發育、免疫逃避及保護作用。HCF是棘球蚴重要的組成部分，也是PSC生長繁殖不可或缺的組分，因為HCF的主要功能之一是為PSC提供發育所需的營養和必要成分[12]，如E.g除缺乏從頭合成脂肪酸和膽固醇的能力，并且還缺乏從頭合成嘧啶、嘌呤和大部分氨基酸(除丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸外)的能力，加之缺乏從頭合成核苷酸的能力，以上營養物質E.g只能從宿主那里獲得[20]，通過對HCF蛋白質組學分析，發現其中存在與PSC發育所需營養物質相關的蛋白質組，如低密度脂蛋白受體，其能夠幫助E.g攝取宿主的甾醇類和脂肪酸[12]；在HCF大量存在的宿主血清蛋白中，主要包括白蛋白、血清鐵傳遞蛋白和血紅蛋白，其中推測白蛋白為PSC提供必要的能源物質，血清鐵轉移蛋白能夠幫助PSC獲取宿主的鐵，血紅蛋白能夠為PSC運輸氧氣和二氧化碳，維持HCF的酸堿度[27]；通過比較不同物種中間宿主(羊、牛和人)體內獲得HCF中鑒定出的蛋白質，發現蛋白質的含量和數量均有差異，如有12個蛋白質只在牛的包囊液(CHCF)中存在，AgB-4在三種中間宿主的HCF中都有出現，但在羊的包囊液(SHCF)中高表達，推測可能與宿主的生理環境不同有關，同時還發現，IgM和補體C3僅在CHCF和人的包囊液(HHCF)中出現，說明對于棘球蚴的出現，不同種宿主之間在最初的反應存在差異[12]。HCF中大量的宿主蛋白質不但能夠為PSC的發育提供所需的營養，也能夠通過分泌在包囊表面，進行抗原偽裝，這與之前的研究結果相同[12]。PSC能夠在具有免疫應答的宿主內存活，HCF中的蛋白質起著重要的作用，如其中的親環蛋白通過與環孢素及CD147作用，能夠調節宿主的炎癥反應，營造適合棘球蚴生存的環境[28]。由于HCF中蛋白質與宿主血漿蛋白的相似性，同時HCF中的蛋白質混合物是處在變化之中，HCF的蛋白質組學分析面臨著挑戰[24，29]。

PSC是E.g生活史中重要的一部分，由GL上的生發囊(brood capsule)產生，是在中間宿主體內存在的主要形式。PSC具有雙向發育的能力，即在中間宿主體內時，可發育為子囊，并通過無性生殖的方式在子囊中產生新的PSC，當進入終末宿主時，在膽汁的刺激下，在終末宿主的小腸內發育為成蟲[19-20]。PSC是E.g生活史中蛋白質組學研究較多的階段之一，對PSC的ES產物中鑒定出的蛋白質進行注釋后，通過GO分析，發現這些蛋白質主要分類為結合與催化，除此之外，還包括抗氧化、酶調節以及轉運功能[14]。在與宿主相互作用過程中，除GL的抗原偽裝外，PSC可釋放ES產物以結合、降解或其他方式與宿主免疫細胞作用，從而對宿主免疫反應進行調節，達到免疫逃避的目的[30]。研究發現，PSC能夠釋放一些蛋白質與宿主的免疫效應物作用，進而調節宿主的免疫反應，通過2-DE免疫印跡發現包蟲病患者血清中鑒定出PSC的14個蛋白質(P-29、E.gTPx、HSP70等)[24]，其中EgTeg能夠引起Th2免疫反應，與E.g慢性感染有關[14]；14-3-3蛋白與抵御細胞介導的免疫有關[14]；TPx能夠保護寄生蟲不受宿主及自身的細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)的破壞，并且在免疫逃避中起重要的作用，TPx在E.g各個階段均有表達，PSC階段表達量較大，在其體表皮層、皮下層和鈣顆粒細胞內分布廣泛[31-32]；鈣蛋白酶在V. G. Virginio等的研究中首次在ES產物中被鑒定出來，與其他絳蟲相似，鈣蛋白酶能夠促進E.g對宿主蛋白的消化和組織的浸潤[14，33]。碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂類代謝及核苷酸代謝是動物寄生性蠕蟲的營養物質代謝主要方式，其中碳水化合物代謝途徑包括糖酵解、三羧酸循環和磷酸戊糖途徑，KEGG通路分析發現，E.g具有完整的碳水化合物代謝途徑[20]。W. Pan等[34]在研究中發現E.g進化出了幾近完美的從宿主獲取能量和營養的策略，不但通過釋放磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK1)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)等調節糖酵解的酶類，這些限速酶通過調節糖酵解能夠合成非必需氨基酸、脂肪酸、腺嘌呤、次黃嘌呤和嘧啶供其生長所需，而且在葡萄糖缺乏時，PSC能夠釋放丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)等酶類進行糖異生反應，從而合成葡萄糖供其生長所需，在V. G. Virginio等的研究[14]中也有相似發現。PSC除在蛋白質水平上與宿主進行相互作用，在PSC還發現鋅指蛋白能夠在轉錄和翻譯水平上調控宿主基因的表達，使宿主的內環境適合PSC的生長發育[13, 34]。在G. B. Dos Santos等的研究中，鑒定出G蛋白伴侶受體超家族的兩個卷曲蛋白，它們在細胞信號轉導和生長發育過程中起主要作用，并且在調節細胞對刺激的反應程度方面有著重要的作用，它們的缺失可能會導致寄生蟲信息傳遞、發育及存活出現問題，最終導致PSC不能產生子囊，甚至死亡[35]。通過將鑒定出的PSC蛋白進行KEGG分析，發現大量蛋白質參與Wnt、Hedgehog和Notch等與蟲體發育密切相關的信號通路，了解PSC蛋白質表達特性，將有助于抗原及診斷靶標候選分子的篩選[36]。PSC是E.g蛋白質組學中研究較多也是較透徹的一個階段，也是進行診斷標志物篩選、藥物靶標篩選及疫苗候選分子篩選中具有較大希望的階段。

綜上所述，在棘球蚴階段，寄生蟲主要通過ES產物與宿主相互作用，一方面利用ES產物直接或間接調節宿主免疫反應，創造適宜的生存環境，例如ES產物中的TPx等，另一方面寄生蟲利用ES產物直接從宿主處獲得營養物質或調節宿主相關代謝途徑，從而獲得能量，例如參與三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle, TCA)的部分酶類[34]，以及參與脂肪合成的FABP等。隨著E.g蛋白質組學研究的不斷深入，發現ES產物在E.g生長發育中具有重要的作用，在ES產物研究過程中，通過篩選將部分ES產物分為診斷標志物、疫苗靶點和藥物靶標的候選蛋白，以期在包蟲病的診斷、預防和治療中提供幫助，見表1。

表1已知蛋白質的潛在應用

Table1Potentialapplicationofknownproteins

GenBank登錄號GenBankID蛋白質Protein氨基酸(aa)Aminoacid應用Application表達階段Stage疫苗候選ART89314.1EG95156疫苗候選幼蟲[37]EgM9疫苗候選成蟲[38]ABG75851.1Myophilin190疫苗候選幼蟲[39]AAF19966.114-3-3protein244疫苗候選成蟲[40]CDS16133.1Leucylaminopeptidase566疫苗候選幼蟲[41]Q02970.2Fattyacid-bindingproteinhomolog1133疫苗候選幼蟲[42]EUB59176.1AntigenEG31634疫苗候選幼蟲[20]AF067807EgA311836疫苗候選幼蟲[43]CDS21034.1ImmunogenicproteinTs11162疫苗候選幼蟲[19]EUB57912.1GlutathioneS-transferase(GST)438疫苗候選、診斷標志物幼蟲[44]診斷標志物CAA81256.1AntigenB65診斷標志物成蟲[45]EUB59176.1EgA13634診斷標志物幼蟲[19]ACA14468.1TropomyosinB224診斷標志物幼蟲及成蟲[46]AAD38373.1EgAgB8/181診斷標志物幼蟲[47]NP_001153220.1EgAgB8/2245診斷標志物幼蟲[48]AAW78439.1AntigenB178診斷標志物幼蟲[49]AAW78460.1AntigenB281診斷標志物幼蟲[49]AAW78445.1AntigenB382診斷標志物幼蟲[49]AAW78450.1AntigenB481診斷標志物幼蟲[49]AAQ74961.1AntigenBsubunit481診斷標志物幼蟲[49]AAZ76567.1AntigenBsubunit178診斷標志物幼蟲[50]AAC14584.1Thioredoxin(TRX)107診斷標志物幼蟲[51]AOY34842.1EpC1174診斷標志物幼蟲[52]CDS15479.1FKBP12rapamycincomplexassociatedprotein3300診斷標志物幼蟲[19]

(轉下頁　Carried forward)

2.2　成蟲的蛋白質組學

E.g的終末宿主在采食含有包囊的內臟后，PSC進入終末宿主(如犬)的體內，在膽酸鹽的刺激下發育為成蟲，寄生終末宿主的小腸中。

E.g通過頭節的吸盤固定在終末宿主的小腸黏膜上，通過表皮吸收食物中的營養，并通過釋放ES產物調節宿主的免疫反應，創造適宜的生長環境。通過寄生蟲與宿主蛋白質共純化的方式，從E.g中鑒定出30個宿主的蛋白質，如激動蛋白、組蛋白、代謝酶類、角質及胞內蛋白等，推測這些蛋白質可能是成蟲從其吸附的腸道上皮細胞中獲得的，并且還發現宿主激素及固有免疫分子，表明成蟲通過攝取宿主蛋白質減輕炎癥反應，從而建立長期感染[13]。另外，研究發現，在成蟲與宿主間的相互作用中，幾種蛋白質發揮著重要的作用，如烯醇酶、親環素硫氧還蛋白過氧化物酶等，其中烯醇酶是成蟲ES產物中含量最多的蛋白質，其是具有多功能的表面蛋白，與建立寄生蟲、宿主之間相互作用和寄生蟲侵襲有關[69]；親環素是成蟲ES產物中第二多的蛋白質，參與寄生蟲發育和寄生蟲、宿主相互作用，并且親環素已開發出免疫療法制劑——親環素A[70]；磷酸烯醇丙酮酸激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)，其中PEPCK涉及多個通路，如內分泌功能、排泄和糖代謝等[13]。在免疫逃避方面，成蟲通過不斷脫落表皮，從而逃避宿主的免疫反應[12]。通路分析發現成蟲能夠通過有氧和無氧糖酵解兩種方式產生ATP[13]。2015年，Y. Wang等對成蟲進行了ES產物和抗原性蛋白的分析，鑒定了9個ES蛋白和13個抗原性蛋白，其中6個抗原性蛋白為首次發現，此研究豐富了E.g蛋白質組學數據，對宿主與寄生蟲相互作用和寄生蟲生存機制的研究提供了相關信息，對E.g的疫苗候選分子和診斷標志物的篩選提供了幫助[15]。

2.3　細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲蛋白質組學差異

隨著在2013年關于E.g和多房棘球絳蟲(Echinococcusmoltilocularis,E.m)全基因組序列的發布[19-20]，為E.g和E.m的蛋白質組學研究奠定了重要的基礎。

雖然E.g和E.m同屬于棘球屬，蛋白質具有較高的同源性，但也存在一定的差異。通過對人體內的細粒棘球蚴和多房泡球蚴蛋白質表達譜進行分析，發現細粒棘球蚴原頭節的蛋白質濃集在相對分子質量72 ku處，囊壁的蛋白質濃集在17、26和72 ku處，囊液的蛋白質濃集在17、26、43～55和72 ku；泡球蚴總蛋白質濃集在26、55～72和72 ku處[71]。和E.g相似，對E.m的蛋白質組學研究中，也發現一些在疫苗研發、診斷標志物篩選及藥物靶標篩選中具有潛力的蛋白質，如Em2、EmⅡ/3、Em10、Em18、Ag5、AgB、Em70、Em90及EmY162等，其中由Em10構建的Pcd-Em10核酸疫苗免疫小鼠，發現對E.m原頭節攻擊具有保護性免疫反應[72]；Em70和Em90具有潛在的多房棘球蚴病血清學診斷價值[73]；EmY162在診斷E.m成蟲的感染方面具有一定的價值[74]。

3　存在的問題

由于目前蛋白質組學研究的相關技術限制，在對蛋白質進行分離時，蛋白質會出現一定量的損失，特別是對于低豐度蛋白質，可能出現分離不到的情況，而某些低豐度蛋白質對E.g功能起重要作用，另外，在棘球蚴階段，包囊液中存在大量的宿主蛋白質，對寄生蟲蛋白質組學分析干擾較大，如何克服這一特性還需要在相關技術上進行改進；目前對于E.g蛋白質組學的分析大多集中在棘球蚴和成蟲階段，特別是在棘球蚴階段研究較為集中，而對其他階段的研究比較少，如果要全面了解E.g完整的蛋白質表達變化，以及診斷試劑、疫苗和藥物的開發，傳播階段的研究不可或缺；缺少系統性E.g的蛋白質組學研究，E.g為多宿主寄生蟲，當寄生的宿主不同，寄生的部位不同，發育階段不同，以及宿主環境變化都會引起E.g蛋白質的變化，系統性了解E.g蛋白質組學，對于預防、診斷和治療E.g引起的人獸共患病有著重要意義；在對E.g進行蛋白質組學分析之后，數據的處理同樣重要，例如基因功能聚類分析、通路富集分析等，而目前相關研究較少。

4　展　望

鑒定蛋白質是蛋白質組學研究的基礎，雖然近些年隨著蛋白質組學研究技術的進步，已鑒定出了許多種E.g蛋白質，但并沒有全覆蓋E.g的蛋白質，未鑒定的蛋白質還有很多，并且已鑒定出的蛋白質許多僅僅是推測，因此E.g蛋白質的鑒定任重道遠。

“工欲善其事，必先利其器”，蛋白質組學研究中涉及到的技術手段有限，常見且主要的有2-DE、MS、WB，因此技術上的改進與創新顯得相當重要，例如在2-DE主要的作用是將蛋白質根據等電點和質量進行分離，但對于豐度較小的蛋白質分離效果較差；目前，MS已不單單是一種技術，而是一套技術，通過與其他技術的聯合使用以及自身的創新，已發展出許多衍生的技術。

隨著絳蟲屬寄生蟲蛋白質組學研究的推進，通過數據比對發現，很多蛋白質是一種或多種寄生蟲共有，有利于疫苗研發和藥物靶標的篩選，可以利用一種蛋白質對多種寄生蟲進行預防和治療，但在免疫診斷方面會產生非特異性的結果，因此要對現有絳蟲蛋白質數據庫進行數據挖掘，發現寄生蟲特有的蛋白質進行研究，將對寄生蟲的疫苗研發、藥物靶標篩選和免疫診斷起到促進作用。

參考文獻(References)：

[1]詹希美. 人體寄生蟲學[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2001.

ZHAN X M. Human parasitology[M]. Beijing: People′s Medical Publishing House (PMPH), 2001. (in Chinese)

[2]BUDKE C M, DEPLAZES P, TORGERSON P R. Global socioeconomic impact of cystic echinococcosis[J].EmergInfectDis, 2006, 12(2): 296-303.

[3]馮海燕, 景志忠, 房永祥, 等. 雙向凝膠電泳技術及其應用[J]. 生物技術通報, 2009(1): 59-63, 68.

FENG H Y, JING Z Z, FANG Y X, et al. Two-Dimensional electrophoresis and its application[J].BiotechnologyBulletin, 2009(1): 59-63, 68. (in Chinese)

[4]ECKERT J, GEMMELL M A, MESLIN F X, et al. WHO/OIE manual onEchinococcosisin humans and animals: a public health problem of global concern[M]. Paris: World Organization for Animal Health and World Health Organization, 2001: 100-142.

[5]THOMPSON R C A, MCMANUS D P. Aetiology: parasites and life cycles[EB/OL]//WHO/OIE Manual onEchinococcosisin humans and animals: A public health problem of global concern. Paris: World Organization for Animal Health and World Health Organization, 2001: 1-19. [2017-12-26]. http://www.oie.int/doc/ged/d11247.pdf.

[6]CRAIG P S. The Echinococcosis working group in China. Epidemiology of human alveolar echinococcosis in China[J].ParasitolInt, 2006, 55 Suppl: S221-S225.

[7]李居怡, 劉巧媚, 黃文靜, 等. 適用于細粒棘球蚴囊液蛋白質組分析的雙向電泳技術[J]. 西安交通大學學報: 醫學版, 2015, 36(5): 711-714.

LI J Y, LIU Q M, HUANG W J, et al. Two-dimensional electrophoresis for proteomics analysis of hydatid fluid of theEchinococcusgranulosus[J].JournalofXi’anJiaotongUniversity:MedicalSciences, 2015, 36(5): 711-714. (in Chinese)

[8]RAPPSILBER J, MONIATTE M, NIELSEN M L, et al. Experiences and perspectives of MALDI MS and MS/MS in proteomic research[J].IntMassSpectrom, 2003, 226(1): 223-237.

[9]許穎, 張錫林. 瘧原蟲蛋白組學的研究進展[J]. 國際醫學寄生蟲病雜志, 2006, 33(2): 96-100.

XU Y, ZHANG X L. The progress of study on plasmodium proteomics[J].InternationalJournalofMedicalParasiticDiseases, 2006, 33(2): 96-100. (in Chinese)

[10]李君良. 細粒棘球絳蟲原頭蚴蛋白質組學研究及生物信息學分析[D]. 銀川: 寧夏醫科大學, 2013.

LI J L. Study on proteomics and bioinformatics of theEchinococcusgranulosusprotoscoleces from infected humans[D]. Yinchuan: Ningxia Medical University, 2013. (in Chinese)

[11]AHN C S, HAN X M, BAE Y A, et al. Alteration of immunoproteome profile ofEchinococcusgranulosushydatid fluid with progression of cystic echinococcosis[J].ParasitVectors, 2015, 8: 10.

[12]AZIZ A, ZHANG W B, LI J, et al. Proteomic characterisation ofEchinococcusgranulosushydatid cyst fluid from sheep, cattle and humans[J].JProteomics, 2011, 74(9): 1560-1572.

[13]CUI S J, XU L L, ZHANG T, et al. Proteomic characterization of larval and adult developmental stages inEchinococcusgranulosusreveals novel insight into host-parasite interactions[J].JProteomics, 2013, 84: 158-175.

[14]VIRGINIO V G, MONTEIRO K M, DRUMOND F, et al. Excretory/secretory products frominvitro-culturedEchinococcusgranulosusprotoscoleces[J].MolBiochemParasitol, 2012, 183(1): 15-22.

[15]WANG Y, XIAO D, SHEN Y J, et al. Proteomic analysis of the excretory/secretory products and antigenic proteins ofEchinococcusgranulosusadult worms from infected dogs[J].BMCVetRes, 2015, 11: 119.

[16]LI J Y, JU Y, WANG X F, et al. Analysis of the chemical components of hydatid fluid fromEchinococcusgranulosus[J].RevSocBrasMedTrop, 2013, 46(5): 605-610.

[18]LONGUESPéE R, CASADONTE R, KRIEGSMANN M, et al. Proteomic investigation of human cystic echinococcosis in the liver[J].MolBiochemParasitol, 2017, 211: 9-14.

[19]TSAI I J, ZAROWIECKI M, HOLROYD N, et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism[J].Nature, 2013, 496(7443): 57-63.

[20]ZHENG H J, ZHANG W B, ZHANG L, et al. The genome of the hydatid tapewormEchinococcusgranulosus[J].NatGenet, 2013, 45(10): 1168-1175.

[21]THOMPSON R C A, LYMBERY A J. Echinococcus and hydatid disease[M]. Wallingford: CAB International, 1995: 1-50.

[23]CAMICIA F, PAREDES R, CHALAR C, et al. Sequencing, bioinformatic characterization and expression pattern of a putative amino acid transporter from the parasitic cestodeEchinococcusgranulosus[J].Gene, 2008, 411(1-2): 1-9.

[24]MONTEIRO K M, DE CARVALHO M O, ZAHA A, et al. Proteomic analysis of theEchinococcusgranulosusmetacestode during infection of its intermediate host[J].Proteomics, 2010, 10(10): 1985-1999.

[25]任一鑫, 戴曉冬, 孫明忠, 等. 寄生蟲與宿主的免疫關系[J]. 中國微生態學雜志, 2014, 26(1): 122-124.

REN Y X, DAI X D, SUN M Z, et al. Relationship between parasite and host in immunology[J].ChineseJournalofMicroecology, 2014, 26(1): 122-124. (in Chinese)

[26]KOSINSKI R J. Antigenic variation in trypanosomes: a computer analysis of variant order[J].Parasitology, 1980, 80(2): 343-357.

[27]張倩, 李居怡, 趙嘉慶, 等. 細粒棘球蚴囊液蛋白質組學的分析研究[J]. 解放軍醫藥雜志, 2013, 25(12): 48-51.

ZHANG Q, LI J Y, ZHAO J Q, et al. Proteomics study on hydatid cyst fluid ofEchinococcusgranulosus[J].Medical&PharmaceuticalJournalofChinesePeople'sLiberationArmy, 2013, 25(12): 48-51. (in Chinese)

[28]YURCHENKO V, CONSTANT S, EISENMESSER E, et al. Cyclophilin-CD147 interactions: a new target for anti-inflammatory therapeutics[J].ClinExpImmunol, 2010, 160(3): 305-317.

[29]CHEMALE G, VAN ROSSUM A J, JEFFERIES J R, et al. Proteomic analysis of the larval stage of the parasiteEchinococcusgranulosus: causative agent of cystic hydatid disease[J].Proteomics, 2003, 3(8): 1633-1636.

[30]HEWITSON J P, GRAINGER J R, MAIZELS R M. Helminth immunoregulation: the role of parasite secreted proteins in modulating host immunity[J].MolBiochemParasitol, 2009, 167(1): 1-11.

[31]LI J, ZHANG W B, LOUKAS A, et al. Functional expression and characterization ofEchinococcusgranulosusthioredoxin peroxidase suggests a role in protection against oxidative damage[J].Gene, 2004, 326: 157-65.

[32]曹得萍, 樊海寧, 毋德芳, 等. 細粒棘球絳蟲在人體內棘球蚴原頭節、囊壁蛋白質表達譜分析[J]. 中國人獸共患病學報, 2014, 30(6): 575-577, 582.

CAO D P, FAN H N, WU D F, et al. Preliminary proteomics analysis on protoscoleces and cyst wall of human hydatid cyst[J].ChineseJournalofZoonoses, 2014, 30(6): 575-577, 582. (in Chinese)

[33]DZIK J M. Molecules released by helminth parasites involved in host colonization[J].ActaBiochimPol, 2006, 53(1): 33-64.

[34]PAN W, SHEN Y J, HAN X M, et al. Transcriptome profiles of the protoscoleces ofEchinococcusgranulosusreveal that excretory-secretory products are essential to metabolic adaptation[J].PLoSNeglTropDis, 2014, 8(12): e3392.

[35]DOS SANTOS G B, MONTEIRO K M, DA SILVA E D, et al. Excretory/secretory products in theEchinococcusgranulosusmetacestode: is the intermediate host complacent with infection caused by the larval form of the parasite?[J].IntJParasitol, 2016, 46(13-14): 843-856.

[36]王正榮, 薄新文, 張艷艷, 等. 細粒棘球絳蟲原頭蚴蛋白表達譜分析[J]. 畜牧獸醫學報, 2017, 48(8): 1519-1528.

WANG Z R, BO X W, ZHANG Y Y, et al. Protein profile analyses of protoscoleces inEchinococcusgranulosus[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2017, 48(8): 1519-1528. (in Chinese)

[37]LIGHTOWLERS M W. Vaccines against cysticercosis and hydatidosis: foundations in taeniid cestode immunology[J].ParasitolInt, 2006, 55 Suppl: S39-S43.

[38]ZHANG W B, LI J, YOU H, et al. A gene family fromEchinococcusgranulosusdifferentially expressed in mature adult worms[J].MolBiochemParasitol, 2003, 126(1): 25-33.

[39]MARTIN R M, CHILTON N B, LIGHTOWLERS M W, et al.Echinococcusgranulosusmyophilin-relationship with protein homologues containing “calponinmotifs”[J].IntJParasitol, 1997, 27(12): 1561-1567.

[40]SILES-LUCAS M, NUNES C P, ZAHA A, et al. The 14-3-3 protein is secreted by the adult worm ofEchinococcusgranulosus[J].ParasiteImmunol, 2000, 22(10): 521-528.

[41]VESSAL M, GHALAMBOR M A. Studies on the enzymes of hydatid cyst fluid. Quantitative determination of enzymes present inEchinococcusgranulosuscyst fluid[J].IsrJMedSci, 1970, 6(3): 383-387.

[42]郝慧芳, 王志鋼, 李志偉. 細粒棘球蚴內蒙株FABP基因cDNA的克隆與核酸疫苗的構建[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2007, 25(4): 352-354.

HAO H F, WANG Z G, LI Z W. Cloning and construction of nucleic acid vaccine of FABP gene cDNA fromEchinococcusgranulosus[J].ChineseJournalofParasitologyandParasiticDiseases, 2007, 25(4): 352-354. (in Chinese)

[43]傅玉才, 許世鍔, 金立群, 等. 細粒棘球絳蟲66kDa抗原基因在成蟲吸盤上的表達[J]. 中國人獸共患病雜志, 2002, 18(2): 41-43.

FU Y C, XU S E, JIN L Q, et al. Expression ofEchinococcusgranulosus66 kDa antigen gene in the suckers of adults[J].ChineseJournalofZoonoses, 2002, 18(2): 41-43. (in Chinese)

[44]李宗吉, 黃瑾, 張靜, 等. 細粒棘球蚴谷胱甘肽S-轉移酶重組抗原的高效融合表達、純化及免疫特性的研究[J]. 中國人獸共患病學報, 2007, 23(1): 76-79.

LI Z J, HUANG J, ZHANG J, et al. Expression and purification of glutathion S-transferase recombinant antigen inEchinococcusgranulosusand its immunogenicity[J].ChineseJournalofZoonoses, 2007, 23(1): 76-79. (in Chinese)

[46]ALVITE G, ESTEVES A.Echinococcusgranulosustropomyosin isoforms: from gene structure to expression analysis[J].Gene, 2009, 433(1-2): 40-49.

[47]MADDISON S E, SLEMENDA S B, SCHANTZ P M, et al. A specific diagnostic antigen ofEchinococcusgranulosuswith an apparent molecular weight of 8 kDa[J].AmJTropMedHyg, 1989, 40(4): 377-383.

[48]SIRACUSANO A, IOPPOLO S, NOTARGIACOMO S, et al. Detection of antibodies againstEchinococcusgranulosusmajor antigens and their subunits by immunoblotting[J].TransRSocTropMedHyg, 1991, 85(2): 239-243.

[49]AREND A C, ZAHA A, AYALA F J, et al. TheEchinococcusgranulosusantigen B shows a high degree of genetic variability[J].ExpParasitol, 2004, 108(1-2): 76-80.

[50]MUZULIN P M, KAMENETZKY L, GUTIERREZ A M, et al.Echinococcusgranulosusantigen B gene family: further studies of strain polymorphism at the genomic and transcriptional levels[J].ExpParasitol, 2008, 118(2): 156-164.

[52]LI J, ZHANG W B, WILSON M, et al. A novel recombinant antigen for immunodiagnosis of human cystic echinococcosis[J].JInfectDis, 2003, 188(12): 1951-1960.

[53]CORTEZ-HERRERA E, YAMAMOTO R R, RODRIGUES J J, et al.Echinococcusgranulosus: cloning and functionalinvitrocharacterization of an actin filament fragmenting protein[J].ExpParasitol, 2001, 97(4): 215-225.

[54]SALINAS G, CARDOZO S.Echinococcusgranulosus: heterogeneity and differential expression of superoxide dismutases[J].ExpParasitol, 2000, 94(1): 56-59.

[55]辛奇, 景濤, 宋曉霞, 等. 細粒棘球絳蟲轉醛醇酶基因的克隆、表達及其潛在免疫診斷價值的研究[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2017, 35(3): 333-338.

XIN Q, JING T, SONG X X, et al. Cloning, expression and potential immunodiagnostic evaluation ofEchinococcusgranulosustransaldolase[J].ChineseJournalofParasitologyandParasiticDiseases, 2017, 35(3): 333-338. (in Chinese)

[56]AGORIO A, CHALAR C, CARDOZO S, et al. Alternative mRNAs arising from trans-splicing code for mitochondrial and cytosolic variants ofEchinococcusgranulosusthioredoxin glutathione reductase[J].JBiolChem, 2003, 278(15): 12920-12928.

[57]DISSOUS C, KHAYATH N, VICOGNE J, et al. Growth factor receptors in helminth parasites: signalling and host-parasite relationships[J].FEBSLett, 2006, 580(12): 2968-2975.

[58]MOGHADAM Z K, GHAFFARIFAR F, KHALILPOUR A, et al. IgG4 detection ofEchinococcusgranulosusparamyosin is a useful diagnostic test for human hydatidosis[J].ClinVaccineImmunol, 2013, 20(4): 501-505.

[59]趙莉, 陳皓斐, 張文寶, 等. 細粒棘球絳蟲Hsp70基因的克隆、表達及抗體制備[J]. 中國農業科學, 2012, 45(12): 2491-2501.

ZHAO L, CHEN H F, ZHANG W B, et al. Cloning, prokaryotic expression ofEchinococcusgranulosusheat shock protein 70 and preparation of it’s antiserum[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2012, 45(12): 2491-2501. (in Chinese)

[60]GAN W J, ZHAO G X, XU H X, et al. Reverse vaccinology approach identify anEchinococcusgranulosustegumental membrane protein enolase as vaccine candidate[J].ParasitolRes, 2010, 106(4): 873-882.

[61]LI J, ZHANG W B, LOUKAS A, et al. Functional expression and characterization ofEchinococcusgranulosusthioredoxin peroxidase suggests a role in protection against oxidative damage[J].Gene, 2004, 326: 157-165.

[62]CHEMALE G, HAAG K L, FERREIRA H B, et al.Echinococcusgranulosusantigen B is encoded by a gene family[J].MolBiochemParasitol, 2001, 116(2): 233-237.

[63]王瑩, 沈玉娟, 袁忠英, 等. 細粒棘球絳蟲親環蛋白基因的克隆 重組表達和生物信息學分析[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2012, 24(3): 294-297, 302.

WANG Y, SHEN Y J, YUAN Z Y, et al. Cloning, expression and bioinformatics analysis of cyclophilin ofEchinococcusgranulosus[J].ChineseJournalofSchistosomiasisControl, 2012, 24(3): 294-297, 302. (in Chinese)

[64]DELUNARDO F, ORTONA E, MARGUTTI P, et al. Identification of a novel 19kDaEchinococcusgranulosusantigen[J].ActaTrop, 2010, 113(1): 42-47.

[65]LI Y Z, XU H X, CHEN J J, et al. Gene cloning, expression, and localization of antigen 5 in the life cycle ofEchinococcusgranulosus[J].ParasitolRes, 2011, 110(6): 2315-2323.

[66]RICHARDSON R T, SIVASHANMUGAM P, HALL S H, et al. Cloning and sequencing of humanEppin: a novel family of protease inhibitors expressed in the epididymis and testis[J].Gene, 2001, 270(1-2): 93-102.

[67]張颋, 賈利芳, 陳英, 等. 細粒棘球絳蟲組織蛋白酶B的重組表達及生物信息學分析[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2014, 26(6): 642-647.

ZHANG T, JIA L F, CHEN Y, et al. Cloning, expression and bioinformatics analysis of cathepsin B ofEchinococcusgranulosus[J].ChineseJournalofSchistosomiasisControl, 2014, 26(6): 642-647. (in Chinese)

[68]王家海, 王凝, 胡丹丹, 等. 細粒棘球絳蟲三磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆、表達及其分子特征的生物信息學分析[J]. 畜牧獸醫學報, 2015, 46(9): 1629-1637.

WANG J H, WANG N, HU D D, et al. Cloning, expression and bioinformatical analysis ofEchinococcusgranulosusglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2015, 46(9): 1629-1637. (in Chinese)

[70]BELL A, MONAGHAN P, PAGE A P. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases (immunophilins) and their roles in parasite biochemistry, host-parasite interaction and antiparasitic drug action[J].IntJParasitol, 2006, 36(3): 261-276.

[71]張耀剛, 李超群, 毋德芳, 等. 細粒棘球蚴和多房泡球蚴在人體內蛋白質表達譜初步分析[J]. 中國人獸共患病學報, 2016, 32(1): 21-23.

ZHANG Y G, LI C Q, WU D F, et al. Preliminary protein expression profiling analysis on human hydatid and alveolar hydatid in Qinghai Province[J].ChineseJournalofZoonoses, 2016, 32(1): 21-23. (in Chinese)

[72]李文桂, 朱佑明, 王鴻, 等. pCD-Em10對泡球蚴感染小鼠免疫應答的影響[J]. 中國免疫學雜志, 2008, 24(2): 99-103, 109.

LI W G, ZHU Y M, WANG H, et al. Effect of pCD-Em10 on immune response in mice infected with alveolar hydatid cyst ofEchinococcusmultilocularis[J].ChineseJournalofImmunology, 2008, 24(2): 99-103, 109. (in Chinese)

[73]KORKMAZ M, INCEBOZ T, CELEBI F, et al. Use of two sensitive and specific immunoblot markers, Em70 and Em90, for diagnosis of alveolar echinococcosis[J].JClinMicrobiol, 2004, 42(7): 3350-3352.

[74]KATOH Y, KOUGUCHI H, MATSUMOTO J, et al. Characterization ofemY162 encoding an immunogenic protein cloned from an adult worm-specific cDNA library ofEchinococcusmultilocularis[J].BiochimBiophysActa, 2008, 1780(1): 1-6.