河北省豬腹瀉相關病毒的檢測及豬流行性腹瀉病毒S基因遺傳變異分析

張若曦，張　志，顧文源，劉天駒，李　翀，王建昌，李　彬，袁萬哲，王玉清，韓慶安*

(1.河北省動物疫病預防控制中心，石家莊 050035； 2.中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032；3.河北出入境檢驗檢疫局技術中心，石家莊 050051； 4.江蘇省農業科學院獸醫研究所，南京 210014；5.河北農業大學動物醫學院，保定 071001)

豬病毒性腹瀉是豬場常見疾病之一，主要病原是豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritisvirus, TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus, PoRV)。這三種腹瀉病毒以單獨或混合感染方式引起豬群嘔吐、水樣腹瀉、脫水、逐漸消瘦等臨床癥狀，對仔豬危害較大，可導致仔豬高死亡率，造成養豬業嚴重的經濟損失[1-2]。自2010年以來，我國多省大范圍暴發以嚴重腹瀉和仔豬高死亡率為癥狀的豬腹瀉病，在2011年和2012年最為嚴重，PEDV變異株的流行是導致此次疫情暴發的主要原因[3-4]。在河北地區，2010年開始暴發腹瀉疫情，腹瀉病高發時期在2011 年至 2012 年間，與其他省份的報道基本一致，而在2013年河北省腹瀉病發生率明顯回落[5-7]。2013年后，河北省鄰近地區腹瀉病發生情況略有不同，山東省部分地區腹瀉病呈現緩和態勢[8-9]，而在山西、遼寧等地腹瀉病仍呈現高發生率和高死亡率[10-11]。為摸清當前河北地區豬病毒性腹瀉的流行狀況和遺傳變異規律，2016年4月至2017年2月，本研究采集河北省11個地市無害化處理廠、門診部和屠宰場發病豬樣品，進行PEDV、TGEV和PRoV的流行病學調查和PEDVS基因的遺傳變異分析，為河北省豬病毒性腹瀉的綜合防控提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　流行病學調查和樣品采集

2016年4月至2017年2月期間，通過對河北省11個地市的無害化處理廠和門診部送檢的1 855例患豬病例進行背景分析，腹瀉發病豬180例。對腹瀉發病豬采集小腸組織或小腸內容物用于后續檢測。

1.2　主要試劑與設備

TaqDNA聚合酶、dNTPs購自上海生工科技有限公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；豬傳染性胃腸炎病毒/流行性腹瀉病毒/輪狀病毒三重核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自中山大學達安基因股份有限公司。

組織研磨儀購自德國Qiagen公司；核酸提取儀購自賽默飛世爾生物科技公司；四通道熒光PCR儀購自西安天隆科技有限公司。

1.3　樣品處理和檢測方法

取腹瀉病料小腸組織樣品或腸內容物加1 mL PBS制成組織勻漿，反復凍融3次；5 000 r·min-1離心5 min，取200 μL上清液進行核酸提取。按熒光PCR檢測試劑盒說明書配制反應體系并加入模板，利用熒光PCR儀，參照試劑盒說明書設定擴增程序進行熒光RT-PCR，待擴增結束后按說明書進行結果判定。

1.4　PEDV S基因引物的設計與目的片段擴增

以PEDV流行株AJ1102株為參考模板，利用Oligo 6.0軟件設計三對用于擴增PEDVS基因的引物(表1)，利用RT-PCR對9份來源不同的PEDV陽性病料擴增S基因，經測序拼接后獲得完整的S基因序列。

1.5　PCR產物回收與測序

PCR產物膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；將膠回收產物送上海生工科技有限公司進行測序。

1.6　測序結果分析

通過BioEdit將所克隆獲得的S基因與GenBank上發表的33條國內外PEDVS基因推導氨基酸序列進行比對分析(表2)。利用MEGA 7.0程序軟件的鄰位相接法(Neighbor-joining 法)進行系統進化樹的構建，并以Bootstrap 值驗證進化樹的可信度。利用NetNGlyc 1.0 Server對S蛋白糖基化位點進行預測。

表1PEDVS全長基因擴增序列

Table1TheprimersusedforamplificationofPEDVSgene

名稱Primer引物序列(5'-3')Sequence退火溫度/℃Temperature片段起止位置Position擴增長度/bpFragmentS-F1S-R1AAGTGGCGCTGTGATTGACAGAAAGAACTAAACCCATTGATA575520376—20393bp22238—22261bp1885S-F2S-R2TTCTTGGCTGTTTTACCTCCTACCCTTCTCGGCGTCAACAACACC606221792—21815bp23360—23480bp1688S-F3S-R3AATGGCCTTGGTACTGTTGATGAACGTGTATTGAAAAAGTCCGAGAAA605823355—23378bp24794—24817bp1462

表2PEDV參考毒株信息

Table2RepresentativePEDVstrainsusedinthisstudy

毒株Strain分離地Collectedarea登錄號AccessionNo.毒株Strain分離地Collectedarea登錄號AccessionNo.AH2012ChinaKC210145SHQP-YM-2013ChinaKJ196348AH2012-12ChinaKU646831SLO-JH-11-2015SloveniaKU297956AJ1102ChinaJX188454SM98SouthKoreaGU937797Attenuated_DR13SouthKoreaJQ023162Tottori2-JPN-2014JapanLC022792CH-AHHF-2-2012ChinaJX018182USA-IL20697-2014USAKT860508CHGD-01ChinaJX261936USA-Iowa106-2013USAKJ645695CH-HNAY-2015ChinaKR809885USA-Iowa107-2013USAKJ645696CH-JX-1-2013ChinaKF760557USA-Iowa303-2014USAKR265827CV777BelgiumAF353511USA-KS-2013USAKJ184549FL2013ChinaKP765609USA-Michigan252-2014USAKR265822GD-AChinaJX112709USA-Minnesota52-2013USAKJ645704JS2008ChinaKC109141USA-Minnesota61-2013USAKJ645705JS-HZ2012ChinaKC210147USA-Ohio126-2014USAKJ645702MF3809SouthKoreaKF779469USA-Texas435-2014USAKR265834OH851USAKJ399978VirulentDR13SouthKoreaDQ862099PC21AUSAKR078299YC2014ChinaKU252649PEDV-LYGChinaKM609212

2　結　果

2.1　病毒性腹瀉流行病學調查

對全年送檢的1 855例患豬病例進行統計分析，其中腹瀉病例共180例，占全年總送檢病例的9.70%。對腹瀉病樣品檢測結果進行統計，發現25份病料有PEDV檢出，檢出率為13.89%；9份病料有PoRV檢出，檢出率為5.00%；TGEV僅在3份病料中檢出，檢出率為1.67%(表3)。對河北地區11地市檢出結果進行分別統計，結果顯示，各地市PEDV和TGEV檢出情況與河北省基本一致，但少數地市PoRV的檢出率偏高(圖1)。綜合以上結果表明，當前PEDV仍是引起河北地區豬群腹瀉病的主要病毒性病原。

對腹瀉病樣品按豬年齡分類進行結果統計，結果顯示，PEDV在仔豬和育肥豬中均有較高檢出率，在仔豬中檢出率最高，可達19.28%；TGEV和PoRV則在育肥豬中檢出率最高，分別達6.90%和13.79%(表3)。

圖1　河北省11地市腹瀉相關病原調查結果Fig.1　Investigation of diarrhea related pathogen from Hebei province

對腹瀉病樣品按采樣點來源進行結果統計，結果顯示，PEDV在無害化處理廠檢出率高達30.00%，而TGEV和PoRV沒有檢出；另外，PEDV和PoRV在門診部均有一定檢出，檢出率分別為17.60%和6.40%，TGEV檢出率僅為1.60%(表3)。

在全年所檢樣品中，PEDV和TGEV發生率均在寒冷的冬春季節最高，在盛夏季節發生率最低；而PoRV發生率在春夏、夏秋季節變換時最高，在盛夏和深冬發生率較低(圖2)，表明在河北地區，春冬季節仍是病毒性腹瀉病原多發季節，而夏季較少發生。

在檢出腹瀉相關病原的樣品中，PEDV單獨感染率最高，達54.70%，PoRV單獨感染率為22.11%，TGEV單獨感染率為10.54%。在所檢測具有腹瀉相關病原的樣品中，PEDV和TGEV共感染率為5.91%，PEDV和PoRV共感染率為6.17%，TGEV和PoRV共感染較少發生，共感染率僅為0.51%(圖3)。所檢樣品中未發現3種腹瀉相關病原共感染情況。以上結果表明，PEDV引起的腹瀉疾病主要以單獨感染為主。

表3河北地區腹瀉相關病毒檢測情況

Table3ThepositiverateofPEDV,TGEVandPoRV

檢測病原Detectedpathogen總體檢出率/%(檢出數)Totaldetectionrate(number)不同類型豬群檢出率/%Detectionrateofdifferenttypesofpigs不同采樣點檢出率/%Detectionrateofdifferentsamplingpoints仔豬Piglet保育豬Nurserypig育肥豬Fatteningpig無害化處理廠Innocuoustreatmentplant門診部ClinicPEDV13.89(25)19.282.7817.2430.0017.60TGEV1.67(3)0.000.006.900.001.60PoRV5.00(9)3.612.7813.790.006.40

圖2　不同月份腹瀉相關病原調查結果Fig.2　Investigation of diarrhea related pathogen collected from different months

圖3　腹瀉相關病原混合感染情況Fig.3　Investigation of diarrhea related pathogen of single infection and co-infection

2.2　PEDV S基因序列分析

S蛋白被認為是PEDV關鍵毒力蛋白，其遺傳變異往往造成毒株毒力改變[12-13]。本研究選取來源不同的9份PEDV病料對S基因進行擴增并進行測序，得到9株PEDVS基因序列，并上傳至GenBank(登錄號：MG132631～MG132639)。經相似性比較分析，發現本研究所獲得的9條S基因核苷酸序列相似性為96.8%～100.0%，推導氨基酸序列相似性為96.4%～100.0%。與GenBank上發表的33條國內外PEDVS基因推導氨基酸序列構建遺傳進化樹(圖4)，發現進化樹主要分為G1、G2和INDELs三支，本研究所獲得的9條S基因全部位于G2上。G2這一大支又可以分為 G2a和G2b小支，本研究所獲得的9條S基因序列中，HB1601(MG132631)和HB1603(MG132632)株位于G2b分支，與美國流行毒株遺傳關系較近；HB16123(MG132637)、HB16134(MG132638)和HB16135(MG132639)株位于G2b分支，與中國流行毒株遺傳關系較近；HB1604(MG132633)和HB1605(MG132634)株以及HB1619(MG132635)和HB1622(MG132636)株位于G2a分支，與當前國內外流行毒株遺傳關系較遠。

圖4　河北地區PEDV毒株S基因氨基酸序列遺傳進化樹Fig.4　Phylogenetic analyses of PEDV strains based on the amino acid sequences of S gene

將所得到的S基因與PEDV變異毒株AH2012進行氨基酸序列比對，發現所測9條S基因氨基酸序列均有多處突變。其中，處于G2b分支上的毒株突變位點較多，達38～39個；處于G2a分支上的毒株與CV777相似突變位點較多，達14個(表4)。此外，HB1601和HB1603在382—383位氨基酸(TY)發生獨特缺失，HB1619和HB1622株在234—236位有三個獨特氨基酸插入(SAW)(表4)。經NetNGlyc 1.0 Server軟件預測AH2012株S蛋白有67處潛在糖基化位點，其中29處為NXT/S糖基化位點。對所獲得的9條S基因氨基酸序列進行糖基化位點預測，發現多條S基因序列因氨基酸突變導致缺失或引入預測糖基化位點，其中HB1601株缺失一處預測NXT/S糖基化位點，HB16123、HB16134和HB16135株增加兩處預測糖基化位點，HB1604和HB1605株分別增加一處預測糖基化位點(表4)。與33株參考序列相比，所獲得9條S基因氨基酸序列均發生多處獨特氨基酸突變，其中HB1601、HB1603、HB1605、HB16123、HB16134和HB16135株在S蛋白核心抗原展示區域均有獨特突變發生(表4)。

3　討　論

PEDV、TGEV 和PoRV是引起豬腹瀉病的主要病毒性病原，均以腹瀉癥狀為主要臨床特征，難以區分。河北地區自2010年開始暴發豬群腹瀉病，在2011年和2012年疫情最為嚴重，2013年疫情趨于穩定[7, 14]。本研究對2016年2月至2017年4月河北地區送檢臨床樣品進行發病情況統計和PEDV、TGEV 和PoRV病原學檢測。調查結果顯示，當前河北省豬群腹瀉病發生率較2010—2013年有明顯緩解。不同于國內南方地區全年腹瀉病均呈高發態勢[6, 15-18]，春冬季節為河北地區病毒性腹瀉病多發季節。通過對腹瀉病料調查，發現PEDV仍是腹瀉病的主要病毒性病原，同時還發現少數地區正在流行PoRV，甚至個別地區PoRV是腹瀉病的主要病原，這提示PoRV在河北省大面積流行的風險正在提高。

2011—2015年間，全國各地PEDV流行毒株以引起仔豬高發病率和高死亡率為主要特征，在保育豬和育肥豬中檢出率較低[19-20]。本研究中，PEDV引起豬群腹瀉病以單獨感染為主，其在腹瀉病樣品中檢出率較之2010—2013年均顯著降低，但在育肥豬腹瀉病料中有較高的檢出率。母源抗體是保護豬群尤其仔豬抵抗PEDV感染的重要途徑，然而其抗體水平往往受病毒感染滴度影響[21-22]。本研究中，河北地區育肥豬的高感染率提示成年豬分泌抗體水平較之2010—2013年可能顯著提高，進而增強對豬群免疫保護能力，降低河北省豬群整體PEDV感染率。

PEDV S 蛋白是病毒發生環境適應的關鍵蛋白，其遺傳變異通常與病毒毒力相關，在分析流行毒株的流行趨勢和遺傳變異中具有重要的進化意義[23]。2010年來，全國多地報道PEDV流行毒株S蛋白與經典毒株變異較大，且分別進化形成多種不同分支[24-27]。Y. Y. Gao等通過對S蛋白遺傳進化分析發現2010年后華北豬場中流行的PEDV毒株與韓國來源毒株進化關系較近[23]。本研究中，所獲得9條PEDV S蛋白氨基酸序列同源性為96.4%～100.0%。遺傳進化分析表明，河北省PEDV S蛋白分處于G2亞群中的2個不同進化分支，均與疫苗株CV777遺傳關系較遠。其中HB1601和HB1603株與美國分離株親緣性較近，HB16123、HB16134和HB16135與國內其他地區分離株親緣性較近，HB1604、HB1605株和HB1619、HB1622株分處的G2a分支則與當前國內外流行毒株遺傳關系較遠，表明，河北地區流行的PEDV優勢毒株可能發生了改變，多種毒株并存。

PEDV S蛋白是Ⅰ型糖蛋白，有27～30個潛在的糖基化位點，這些糖基化位點往往與病毒毒力相關[13, 27]。其在S1區N端包含1個信號肽(l～18 aa)，在S1和S2膜外域編碼4個抗原表位(499—638、748—755、764—771和1 368—1 374 aa)，其中499—638 aa為誘導中和抗體產生的核心區域，亦稱為COE抗原區域[28-29]。T. Sato等將PEDV在細胞上連續傳代致弱，發現S蛋白信號肽、S1和S2膜外區的氨基酸突變是造成毒株毒力減弱的關鍵因素[30]。本研究對9株PEDV S蛋白氨基酸序列分析，結果顯示與國內流行毒株AH2012相比，9株S蛋白氨基酸序列均發生多處突變，部分突變位點與CV777疫苗株相同。同時，與33株參考序列相比，9株S蛋白氨基酸序列在S蛋白膜外區均發生多處獨特性突變，表明PEDV S蛋白在河北地區的進化方向具有多樣性，其是否影響S蛋白毒力和抗原性尚不得而知。其中，HB1601和HB1603在382—383 aa缺失兩位氨基酸(TY)，HB1619和HB1622在234—236 aa插入三位氨基酸突變位點(SAW)，這一插入缺失特征目前尚未有報道。通過生物信息學軟件分析發現，在HB1601、HB16123、HB16134、HB16135、HB1604和HB1605株中一些位點突變的發生可能會引起S蛋白糖基化位點失活或引入，推測這些位點突變有可能導致S蛋白毒力改變。此外，與33株參考序列相比，G2a分支和G2b分支S蛋白在COE區分別發生兩處和三處獨特性突變，這些突變可能會影響COE誘導中和抗體能力，改變毒株抗原性。綜上，河北地區PEDVS基因進化分支較多，S蛋白的多種獨特突變可能導致PEDV流行毒株毒力和抗原性改變，這一推測有待進一步研究證實。

4　結　論

2016年河北地區腹瀉發生率較以往有所下降，PEDV對仔豬的感染情況有所緩解，而對育肥豬感染率較高。PEDVS基因氨基酸序列分析表明，河北省PEDV流行毒株分布在G2群中的2個進化分支，部分毒株發生獨特氨基酸突變。

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