FGF7亞家族在小鼠毛囊第一生長周期的表達

牛　姝，程笳琪，高淑媛，曹校瑞，吳晉強，陸　娜，閆瑞琴，赫曉燕

(山西農業大學動物科技學院，太谷 030801)

毛囊(Hair follicle,HF)是一個高度敏感的小器官，具有重建自身的能力。在出生后的生活中，其周期變換從快速生長期(生長期)開始，通過凋亡驅動回歸期(退行期)到達相對靜止(靜止期)[1-2]。這種周期性變化受多種因素的影響。其中，成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)家族由7個亞家族組成，相關研究表明，FGF7亞家族(包括FGF7、FGF10和FGF22)對皮膚發育和修復起重要作用[3-5]。D.Schmid等[6]研究表明，FGF7和頭蛋白(Noggin)對于誘導新的毛發生長周期起到重要作用。FGF10多存在于小鼠的肺、心和皮膚真皮部分，具有促進毛發生長的生物活性，對于治療脫發有重要作用[7]。在成年小鼠皮膚中，FGF22在毛囊的內根鞘中表達[8]。FGF22也可用作受損傷口愈合和其他上皮中可能出現的損傷的治療工具，對皮膚發育和修復起重要作用[9]。而在小鼠第一個毛囊生長周期中，FGF7亞家族對其作用的研究未見報道。根據前人對于小鼠毛囊周期結構的研究，結合本試驗小鼠出生后毛囊的生長情況，確定毛囊第一個生長周期的劃分大致為第1～11天為生長期，第12～17天為退化期，第18～19天為靜止期，第20天毛囊開始進入下一個生長周期。本研究利用實時熒光定量PCR技術、免疫組織化學技術和Western blot技術，對FGF7/FGF10/FGF22在小鼠第一生長周期不同階段皮膚組織中的表達進行研究，觀察FGF7/FGF10/FGF22在小鼠第一個毛囊生長周期不同階段的差異表達，以了解FGF7/FGF10/FGF22對小鼠第一個毛囊生長周期的作用，為揭示FGF7亞家族對小鼠毛發生長調節機制奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1　試驗動物

出生后第1、3、5、8、16、18、20、23 天的白色ICR(Institute of Cancer Researcch)小鼠，每天各取3只，每只背部取約2 cm2的皮膚組織塊2份。1份液氮保存；1份浸蠟固定包埋。

1.2　主要儀器與試劑

FGF7兔抗多克隆抗體(Thermo公司)；FGF10兔抗多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)；FGF22兔抗多克隆抗體(Novus Biologicals公司)；兔Streptavidin-HRP DAB試劑盒和高靈敏度化學發光檢測試劑盒(康為世紀公司)；凝膠配制試劑盒和RIPA裂解液(強)(碧云天公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和PrimeSciptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司)。

1.3　方法

1.3.1免疫組織化學按照兔Streptavidin-HRP試劑盒(DAB)說明書進行試驗。將組織切片于高濃度至低濃度的梯度酒精中復水，滴加試劑Ⅰ(H2O2內源性過氧化物酶封閉液)于37 ℃烘箱內10 min，PBS沖洗。滴加試劑Ⅱ(正常山羊血清)封閉，37 ℃靜置10 min。棄掉血清，切片上一組滴加1∶60稀釋的兔抗FGF7多克隆抗體(1∶45稀釋的兔抗FGF10多克隆抗體；1∶50稀釋的兔抗FGF22多克隆抗體)，對照組滴加等量的血清封閉液，37 ℃烘箱30 min后，置于冰箱4 ℃過夜，第2天室溫復溫30 min，PBS沖洗，滴加試劑Ⅲ(生物素標記羊抗兔二抗工作液)，37 ℃放置10 min。PBS沖洗，滴加試劑Ⅳ(HRP標記的鏈霉親和素)，PBS沖洗；滴加DAB顯色液，觀察顯色效果適當調整時間(最多不超過5 min)，蒸餾水沖洗，蘇木精復染1 min，蒸餾水沖洗，再經低濃度至高濃度酒精脫水二甲苯透明，中性樹膠封片。利用Leica光學顯微鏡觀察切片，并采集圖片。每一個樣本選擇3張片子，每個片子上選取至少3個以上視野進行拍照。并且應用圖像分析軟件Image-Proplus 6.0對出生前后小鼠切片中FGF7、FGF10和FGF22的陽性反應物進行光密度測定，并進行數據分析。

1.3.2Western blot檢測根據RIPA裂解液(強)說明書提取總蛋白，每孔蛋白上樣量為400 ng，在12% SDS-PAGE進行電泳分離，電泳完120 V 1 h轉至NC膜，5%的脫脂蛋白干粉封閉1 h，4 ℃過夜孵育一抗(1∶800稀釋的兔抗FGF7多克隆抗體；1∶500稀釋的兔抗FGF10多克隆抗體；1∶700稀釋的兔抗FGF22多克隆抗體)。次日室溫復溫30 min，TBST緩沖液沖洗10 min×3，孵育二抗(1∶12 000，HRP-山羊抗兔IgG，康為世紀公司；1∶12 000，HRP-山羊抗鼠IgG，康為世紀公司)，37 ℃搖床1 h，TBST緩沖液 5 min×4，最后，NC膜涂發光液利用凝膠成像系統進行曝光，并在暗室中壓膠片。使用Image J軟件對FGF7、FGF10、FGF22和內參β-actin蛋白的結果圖進行灰度值測定。

1.3.3實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測根據NCBI中登錄的小鼠(Musmusculus)FGF7(序列號：NM_008008.4)、FGF10 (序列號：NM_008002.4)和FGF22(序列號：NM_023304.1)與β-actin(序列號：NM_007393.5)基因的序列，運用Primer5.0進行特異性引物設計，并送華大基因公司合成。引物序列見表1。

表1目的基因與內參β-actin引物序列

Table1Primersequencesoftargetgenesandβ-actin

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductssize退火溫度/℃AnnealtemperatureFGF7F:ATGCTTCCACCTCGTCTGTR:ATCTCCTGGGTCCCTTTCA22258FGF10F:TGGTGTCTTCGTTCCCTGTR:GCTGACCTTGCCGTTCTT21858FGF22F:TGGGTTGCGGGTCTACTCTR:TCGTGTCCGTCTGCCTTGC15762β-actinF:GCTGTCCCTGTATGCCTCTR:GATGTCACGCACGATTTCC22258～62

取液氮罐中的組織按照 Trizol試劑盒說明書提取不同天數小鼠皮膚組織的總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的片段DNA，送華大基因公司測序。按照試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，并調整濃度為100 ng·μL-1。每個樣本進行3次有效重復。反應體系：SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)5 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，FGF7/FGF10/FGF22/β-actin正反向引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，dH2O(滅菌蒸餾水)3 μL。FGF7和FGF10反應條件：95 ℃預變性10 min;94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環；FGF22反應條件：95 ℃預變性10 min;94 ℃變性5 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。擴增結束得到CT值，利用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達水平，各基因差異倍數以2-ΔΔCT表示。

1.4　數據分析

免疫組化光密度值結果用“平均值±標準差(mean±SE)”表示，免疫組化光密度值、Western blot和RT-PCR統計結果利用SPSS17.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析，各基因蛋白表達差異顯著程度均以最低表達天數為對照。其中，*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01表示差異極顯著。

2　結　果

2.1　FGF7、FGF10和FGF22蛋白在出生后小鼠皮膚組織中的定位

免疫組織化學結果顯示，在毛囊第一生長周期，FGF7主要表達于毛囊內根鞘及表皮(圖1)。第1天主要表達于表皮；第3、5、8、16和18天主要表達于內根鞘和表皮；第20 天表達較為廣泛，在內外根鞘及毛囊間真皮成纖維細胞等均有表達；第23天主要在內根鞘和表皮有陽性反應。FGF10在出生后毛囊的表達較為廣泛，在表皮、皮脂腺等均有陽性反應(圖2)。第1天主要表達于表皮，第3 天開始在毛囊各結構廣泛表達，第18天皮脂腺處陽性反應較強。FGF22在毛囊第一生長周期中表達較為廣泛，毛基質、內根鞘及外根鞘等均有陽性反應，但在不同階段，其表達的強弱不同(圖3)。光密度數據分析結果顯示，FGF7、FGF10和FGF22蛋白在不同階段組織中的表達水平均存在顯著差異，其中FGF7在第5天表達量最高，第16天降至最低，伴隨靜止期的開始，FGF7在毛囊中的表達量逐漸升高。第1、3、5、8、18、20、23天的表達量極顯著高于第16 天(P<0.01)，其表達量分別是第16 天的1.250倍、1.470倍、1.636倍、1.142倍、1.102倍、1.335倍和1.616倍(表2，圖4A′)。FGF10與FGF7趨勢相似，在第3天表達量達到最高，第8天表達量降至最低，退化期～第二生長期的相對表達量逐漸增高。第1、3、5、16、18、20、23天的表達量極顯著高于第8天(P<0.01)，其表達量分別是第8天的1.302倍、1.975倍、1.244倍、1.218倍、1.300 倍、1.350倍和 1.680倍(表2，圖4B′)。FGF22在第16天表達量達到最高，之后隨著時間增加表達量逐漸降低。第1、3天的表達量顯著高于第23天(P<0.05)，第5、8、16、18、20天的表達量極顯著高于第23 天(P<0.01)。第1、3、5、8、16、18、20 天分別是第23天的1.093倍、1.147倍、1.235倍、1.336 倍、1.712倍、1.506倍和 1.358倍(表2，圖4C′)。

A～H.不同天數小鼠背部皮膚毛囊的陰性反應；a～h.不同天數小鼠背部毛囊的陽性反應。A和a.1 d；B和b.3 d；C和c.5 d；D和d.8 d；E和e.16 d；F和f.18 d；G和g.20 d；H和h.23 d。1.毛乳頭；2.毛基質；3.內根鞘；4.外根鞘；5.表皮；6.皮脂腺。下同A-H.Hair follicle negative reaction of different days in mice back skin; a-h.Hair follicle positive reaction of different days in mice back skin. A and a.1 d; B and b.3 d; C and c.5 d; D and d.8 d; E and e.16 d; F and f.18 d; G and g.20 d; H and h.23 d. 1.Dermal papilla; 2.Hair matrix; 3.Inner root sheath; 4.Outer root sheath; 5.Epidermis; 6.Sebaceous glands.The same as below圖1　FGF7蛋白在小鼠毛囊第一生長周期皮膚的定位(20×)Fig.1　Location of FGF7 protein in mice skin in the first hair follicle cycle(20×)

圖2　FGF10蛋白在小鼠毛囊第一生長周期皮膚的定位(20×)Fig.2　Location of FGF10 protein in mice skin in the first hair follicle cycle(20×)

表2陽性表達的平均光密度

Table2Averageopticaidensityofpositivecellsinpostnatalmiceskin

項目Item1d3d5d8d16d18d20d23dFGF70.2039±0.005**0.2398±0.001**0.2669±0.003**0.1863±0.003**0.1631±0.00020.1798±0.0001**0.2179±0.010**0.2637±0.006**FGF100.2236±9.615E-06**0.3391±0.005**0.2136±0.001**0.1717±0.0010.2091±0.001**0.2229±0.009**0.2319±0.002**0.2885±0.002**FGF220.2504±0.002*0.2626±0.012*0.2829±0.004**0.3060±0.006**0.3939±0.007**0.3450±0.003**0.3111±0.005**0.2290±0.009

*.P<0.05;**.P<0.01。下同

*.P<0.05;**.P<0.01.The same as below

圖3　FGF22蛋白在小鼠毛囊第一生長周期皮膚的定位(20×)Fig.3　Location of FGF22 protein in mice skin in the first hair follicle cycle(20×)

A.生長期；C.退行期；T.靜止期。下同A.Anagen.C.Catagen,T.Telogen.The same as below圖4　FGF7(A′)、FGF10(B′)和FGF22(C′)蛋白在小鼠皮膚的平均光密度分析Fig.4　Average optical density analysis of FGF7(A′), FGF10(B′) and FGF22(C′) protein in mice skin

2.2　FGF7、FGF10和FGF22蛋白在小鼠皮膚組織中的表達

Western blot結果顯示，在小鼠毛囊第一生長周期中均存在與FGF7、FGF10、FGF22多克隆抗體發生陽性反應的條帶，FGF7大小為27 ku，FGF10大小為23 ku，FGF22大小為21 ku(圖5)。通過分析得出，FGF7蛋白在第16天表達量最低，伴隨靜止期的開始，表達量逐漸升高。第1、3、5、18、20、23天的表達量極顯著高于第16天(P<0.01)，第8 天的表達量顯著高于第16天(P<0.05)。第1、3、5、8、18、20、23 天分別是第16天的1.643倍、2.045倍、1.523倍、1.407倍、1.739倍、1.974倍、2.035倍(圖6A′)。FGF10蛋白在第8天表達量最低，第1、3、5、16、18、20、23天的表達量極顯著高于第8天(P<

0.01)，其表達量分別是第8 天的1.390倍、2.632倍、1.403倍、1.374倍、2.468倍、2.755倍、3.101倍(圖6B′)。FGF22在第16天的相對表達量達到最高，其后隨著毛囊萎縮進入靜止期表達量逐漸降低。第3、5、8、16、18、20、23天的表達量極顯著高于第1 天(P<0.01)，且表達量是第1天的1.601倍、1.870倍、2.198倍、2.474倍、2.378倍、1.878倍、1.533倍(圖6C′)。

圖5　FGF7、FGF10和FGF22蛋白在小鼠皮膚的蛋白印跡Fig.5　Western blot band of FGF7,FGF10 and FGF22 protein in mice skin

圖6　FGF7(A′)、FGF10(B′)和FGF22(C′)蛋白在小鼠皮膚的相對表達量Fig.6　Relatire expression of FGF7(A′),FGF10(B′) and FGF22(C′) proteins in mice skin

2.3　FGF7、FGF10和FGF22基因在小鼠皮膚組織中的表達

RT-PCR結果顯示，在小鼠毛囊第一生長周期中，FGF7在第16天的表達量最低，伴隨靜止期的開始，FGF7在毛囊中的表達量逐漸升高，第1、3、5、8、20、23 天極顯著高于第16天(P<0.01)，第18 天顯著高于第16天(P<0.05)。第1、3、5、8、18、20、23 天的表達量分別是第16天的1.819倍、3.703倍、3.551倍、1.347倍、1.165倍、2.287倍和2.502倍(圖7A′)。FGF10在第3天表達量達到最高，在第8天表達量降至最低，退化期開始表達量逐漸增高。第1、3、5、16、18、20和23天的表達量極顯著高于第8 天(P<0.01)，第16天顯著高于第8天(P<0.05)。第1、3、5、16、18、20和23天分別是第8 天的2.640倍、4.686倍、2.095倍、1.135倍、1.327倍、1.532倍和2.278倍(圖7B′)。FGF22在第16天的表達量達到最高，其后隨著毛囊萎縮進入靜止期表達量逐漸降低。第1、3、5、8、16、18和20天的表達量極顯著高于第23天(P<0.01)，且表達量分別是第23 天的2.037倍、14.530倍、21.523倍、31.649倍、40.176倍、31.741倍和26.153倍(圖7C′)。

圖7　FGF7(A′)、FGF10(B′)和FGF22(C′) mRNA在小鼠皮膚的相對表達量Fig.7　Relative expression of FGF7(A′),FGF10(B′) and FGF22(C′) mRNA in mice skin

3　討　論

毛囊是一種通過組織生長和重塑循環產生毛發的動態結構。毛囊發育主要經歷生長期(Anagen)、退行期(Catagen)和靜止期(Telogen)3個時期[1-2]。在生長期，毛乳頭從真皮生長到皮下組織，毛母質細胞末梢產生角質形成細胞分化層并形成毛囊內根鞘和毛干，毛囊長度逐漸達到最大，且毛囊各結構清晰可見易于識別。隨著毛基質細胞的供給下降，毛囊進入退行期，毛囊及整體皮膚厚度均在縮減，當毛乳頭逐漸變為緊湊的球形，毛囊進入靜止期，此時毛囊不顯示內根鞘結構并完全由毛囊間真皮成纖維細胞包圍。毛囊的周期變化發育受到各種生長因子的影響。

FGF7是由上皮組織中的間充質細胞(例如成纖維細胞/纖維細胞)合成和分泌的，具有163個氨基酸編碼的糖蛋白，同時FGF7作為上皮細胞增殖的旁分泌介質，并具有刺激上皮細胞的遷移、擴散和增殖的作用[10-12]。已有研究顯示，FGF7是負責指導毛胚細胞增殖并誘導新毛發生長周期的毛乳頭信號[6]。據程毅[13]研究可知，毛乳頭啟動新的毛囊周期。在真表皮相互作用中, 真皮成分起主導作用，但表皮成分可反作用于間質, 例如角質形成細胞可產生一種特異因子刺激體內的毛乳頭細胞生長[14]。M.V.Plikus[15]發現誘導新毛發周期開始需要多種信號通路共同調節。在靜止期前激活態的FGF7信號(由FGFR2 IIIb受體介導)表達量較低，在靜止期時，開始激活更多的FGF7信號。本研究免疫組化結果表明，FGF7小鼠第一生長周期中主要在毛囊內根鞘及表皮表達。可能是因為FGF7對于角質形成細胞增殖、存活、分化有重要作用。本研究的免疫組化光密度值、實時熒光定量PCR及Western blot結果均顯示FGF7在靜止期和第二生長期的相對表達量顯著高于生長期和退行期，結果與M.V.Plikus[15]一致。此研究結果提示，FGF7可能對小鼠毛囊生長早期發育與誘導毛囊進入新的循環周期有重要作用。

FGF10又可稱為角質形成細胞生長因子-2(KGF-2)，以旁分泌方式介導間充質與上皮信號傳導，在多個器官中發揮重要的作用[16-17]。K.Suzuki等[18]研究發現，在缺乏FGF10的新生小鼠皮膚組織中基底層的增殖細胞數目在減少，顆粒層發育不全，缺乏獨特的透明角質顆粒和張力原纖維，缺乏FGF10，表現為表皮形態異常。M.Igarashi等[19]研究表明，FGF10長期在人皮膚的真皮乳頭細胞、外根鞘細胞和表皮角質形成細胞表達。J.H.Jang[20]研究發現，在大腸桿菌中表達的rhKGF-2具有促進人毛發生長的生物活性，提示rhKGF-2對毛發生長有刺激作用。本研究免疫組化結果顯示，FGF10在小鼠皮膚中表達較為廣泛，表皮、皮脂腺等均有陽性反應，與M.Igarashi等[19]結論一致。出生后1 d，只在表皮表達，可能是因為FGF10刺激上皮細胞增殖，從而為毛母質細胞的增殖分化提供基礎。免疫組化光密度、實時熒光定量與Western blot結果均表現為毛囊生長期初中期與靜止期～第二生長期初期的相對表達量高于生長末期和退化期。在生長期末期FGF10的表達減弱，可能由于內外根鞘的分化及真皮乳頭逐漸減少消失，導致表達量降低，與前人研究結果一致。此研究結果提示，FGF10可能對于誘導毛囊進入新的循環周期同樣起重要作用。

FGF22是與FGF7和FGF10密切相關的FGF7亞家族的另一成員，參與表皮內穩態。除了FGF7和FGF10，FGF22也可用作治療受損傷口愈合的工具，且用于其他上皮中可能存在的損傷的治療。C.L.Li等[21]研究FGF22在發育過程中的表達譜，表明FGF22在毛囊形態發生中具有潛在的作用。免疫組化結果顯示，在小鼠皮膚中，FGF22在各天數毛囊中存在不同程度的廣泛表達，外根鞘、表皮及皮脂腺等均有表達。免疫組化光密度值、實時熒光定量PCR及Western blot檢測均顯示，FGF22在毛囊生長期后期及退化期前期的相對表達量最高，其后隨著毛囊萎縮進入靜止期逐漸降低。提示FGF22對于誘導毛囊進入退化可能有重要影響。

T.A.Beyer等[22]研究表明，FGF22蛋白質與FGF7和FGF10相反，缺乏大多數分泌型FGF應有的特征，即N-糖基化的共有序列。同時Y.Katoh等[23]通過比對哺乳動物的FGF7啟動子、FGF10啟動子和FGF22啟動子，發現具有bHLH結合位點和CCAAT盒的FGF7啟動子與具有雙bHLH結合位點的FGF10啟動子較為保守，而FGF22啟動子則不同，表明FGF22與FGF7、FGF10之間有較大差異。結合本研究結果可知，FGF7、FGF10在小鼠出生后毛囊生長期表達量大，在毛囊退化期表達量逐漸減少，在靜止期～第二生長期表達量則逐漸增加，而FGF22則主要在毛囊生長期末期～退化期早期高表達，在靜止期表達逐漸降低。提示FGF7、FGF10在毛囊發育過程中可能對小鼠毛囊生長早期發育與誘導毛囊進入新的循環周期有重要作用，而FGF22則可能對誘導毛囊進入退化期有重要影響。

4　結　論

本研究結果表明，在小鼠第一生長周期過程中，FGF7主要表達于毛囊內根鞘及表皮，FGF10和FGF22廣泛表達于毛囊各部。RT-PCR、Western blot和免疫組化光密度統計結果表明，FGF7在毛囊退化期表達量最低，在靜止期、生長期高表達；FGF10在毛囊生長期末期逐漸降低，退化期開始逐漸升高；FGF22在毛囊退化期表達量最高，在靜止期、生長期低表達。提示FGF7、FGF10在毛囊第一生長周期可能對誘導毛囊進入新的循環周期有重要作用，而FGF22則可能對誘導毛囊進入退化期有重要影響。

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