綿羊FGF 7基因組織表達(dá)及其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系

周　梅，曹曉涵，賀小云，孫　慶，狄　冉，胡文萍，王翔宇，張效生，張金龍, 劉秋月*，儲(chǔ)明星*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193; 2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

在世界上現(xiàn)有的近700個(gè)綿羊品種中，僅少數(shù)品種具有產(chǎn)羔數(shù)多的特點(diǎn)，其余多屬產(chǎn)單羔，因此，如何有效提高綿羊的繁殖力一直都是育種學(xué)家最關(guān)注的熱點(diǎn)之一。D.Gabia[1]報(bào)道，將繁殖性狀合并為一個(gè)選擇指數(shù)，根據(jù)母綿羊各自的生產(chǎn)性能對(duì)母羊進(jìn)行選擇時(shí)，產(chǎn)羔數(shù)是其中最重要的一個(gè)，因?yàn)樗鼘?duì)遺傳進(jìn)展的經(jīng)濟(jì)效益貢獻(xiàn)為74%～96%，因此，找到與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因?qū)⒔o養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而分子標(biāo)記可以從遺傳基礎(chǔ)上解釋綿羊產(chǎn)多羔的機(jī)制，是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的有效方法。

鑒于全基因組重測(cè)序是目前功能基因挖掘最主要的方式之一[2-6]，本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)10個(gè)綿羊品種的99個(gè)個(gè)體進(jìn)行全基因組重測(cè)序，通過(guò)將重測(cè)序的9個(gè)綿羊品種按照單、多羔進(jìn)行分組，使用Fst方法對(duì)多羔組和單羔組分化程度進(jìn)行分析，鑒定選擇信號(hào)，以篩選綿羊多羔相關(guān)基因，并定義 Z(Fst) >5為顯著位點(diǎn)。從而篩選獲得可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7(Fibroblast growth factor 7,FGF7)，其Z(Fst)值為6.629 724 9。全基因組Fst檢驗(yàn)[7]可以通過(guò)比較單個(gè)位點(diǎn)Fst值找到局部受到選擇的基因，F(xiàn)st值越大表明位點(diǎn)遺傳分化程度越高(0

FGF 7是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員之一，它與哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育密切相關(guān)[8-11]，且被定位于綿羊7號(hào)染色體上，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，完整的編碼區(qū)全長(zhǎng)為585 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度為194個(gè)氨基酸。FGF7通過(guò)與受體FGFR 2結(jié)合參與牛卵泡發(fā)育[12-13]，它通過(guò)加快卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞之間的信息交換，促進(jìn)哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟，最終影響排卵。B.Berisha等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF7可能參與母牛卵泡成熟以及黃體的生成。J. H. Cho等[16]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF 7通過(guò)KIT/KITLG信號(hào)通路促進(jìn)牛卵母細(xì)胞生長(zhǎng)。P.Kezele等[13]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF7的存在使得大鼠卵巢中65%的原始卵泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)變，而對(duì)照組僅有45%，其原因與J. H. Cho等[16]的研究結(jié)果一致，主要在于原始卵泡中發(fā)育的顆粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生KITLG(KIT Ligand)，KITLG是一種干細(xì)胞因子，它能夠顯著增加進(jìn)入募集周期的原始卵泡的數(shù)量，卵巢中的KITLG能夠與FGF 7相互作用，從而對(duì)卵巢表面的上皮細(xì)胞和大有腔卵泡的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，而卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生的FGF 7能促進(jìn)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生KITLG，如此形成一個(gè)正反饋回路，共同促進(jìn)卵泡發(fā)育[17-18]。然而，F(xiàn)GF 7對(duì)于山羊初級(jí)卵泡的發(fā)育并沒(méi)有促進(jìn)作用，取代FGF 7角色的是FGF 10[19]。

FGF7基因在哺乳動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPGA)表達(dá)量較高，而HPGA是哺乳動(dòng)物生殖內(nèi)分泌活動(dòng)的中心[20]，其中，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)對(duì)促卵泡素(Follicle-stimulating hormone, FSH)和促黃體素(Luteinizing hormone, LH)等重要生殖激素的分泌有著非常關(guān)鍵的調(diào)控作用[12,21]。結(jié)合前人的研究結(jié)果，推測(cè)FGF7基因可能正是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)生殖激素的分泌，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育和卵子發(fā)生，最終對(duì)排卵活動(dòng)產(chǎn)生影響，而綿羊的產(chǎn)羔數(shù)直接受到排卵數(shù)的影響[22-24]，因此，猜測(cè)FGF7基因可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀有關(guān)。鑒于小尾寒羊是中國(guó)優(yōu)良的地方綿羊品種，以其繁殖力較高而被譽(yù)為“國(guó)寶”，而蘇尼特羊以肉質(zhì)和口感好著稱，但其產(chǎn)羔率一直較低，多產(chǎn)單羔，因此，本研究對(duì)FGF7基因在多羔小尾寒羊和單羔蘇尼特羊以及小尾寒羊FecB不同基因型(BB、B+和++)組織間的表達(dá)特性以及通過(guò)重測(cè)序篩選出來(lái)的FGF7基因g.57842893C>T位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行研究，以揭示二者與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系及其影響產(chǎn)羔數(shù)的機(jī)制，為綿羊分子育種提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　樣品采集和主要試劑

多羔小尾寒羊和單羔蘇尼特羊以及FecB不同基因型小尾寒羊均來(lái)自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場(chǎng)。其中，多羔小尾寒羊和單羔蘇尼特羊均處于非發(fā)情狀態(tài)，F(xiàn)ecB不同基因型小尾寒羊均處于黃體期，每組分別挑選2～3歲健康狀況良好成年母羊3只，多羔小尾寒羊選擇的是313號(hào)、332號(hào)和473號(hào)，313號(hào)羊第1、2和第3胎次產(chǎn)羔數(shù)分別為1、2、3，332號(hào)分別為3、3、3，473號(hào)分別為2、2、3。在同期發(fā)情后第7天對(duì)挑選的綿羊進(jìn)行屠宰，采集心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺、卵巢、輸卵管、子宮體、子宮角、瘤胃、大腸、小腸以及腎脂19種組織。在屠宰后，盡快將采集的新鮮組織裝入2 mL的RNase-Free凍存管中，并立即置于液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后，全部轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司(北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)和熒光定量染料(SYBR?Premix ExTaqTMⅡ)均購(gòu)于TaKaRa公司(大連)；TaqPCR Master Mix購(gòu)于拓英坊科技有限公司(北京)；分型試劑和儀器均來(lái)自君諾德生物技術(shù)有限公司(北京)。

1.2　組織總RNA的提取和檢測(cè)

采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根，北京)加Trizol(Invitrogen, 美國(guó))提取各組織總RNA，并用Nanodrop2000檢測(cè)了提取RNA的濃度和OD值，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.3　引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的綿羊FGF7基因mRNA序列的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本(登錄號(hào)分別為NM_001009235.2和XM_012180603.2)所共有的序列，利用Primer 3在線軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以β-actin(NM_001009784)作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物名稱和序列、退火溫度、擴(kuò)增片段大小以及用途見(jiàn)表1。

1.4　cDNA合成

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL：PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 4.0 μL，RNA 1.0 μL，再用RNase-Free ddH2O將總體積補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA第一鏈。全程操作在冰上進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋，用持家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測(cè)，將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA置于-20 ℃保存，以用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

表1綿羊FGF7基因的引物信息

Table1PrimerinformationofFGF7geneinsheep

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature擴(kuò)增片段/bpProductsize用途UsageFGF7-1-FFGF7-1-RTGGAAATCAGGACAGTGGCTCATTTCTCCTCCGCTGTGTG61197sqRT-PCRFGF7-2-FFGF7-2-RCCGAGCGACATACAAGAAGTTACCACTGTCCTGATTTCCATGA60165qPCRβ-actin-Fβ-actin-RGCTGTATTCCCCTCCATCGTGGATACCTCTCTTGCTCTGG6097sqRT-PCR和qPCR

1.5　sqRT-PCR反應(yīng)

sqRT-PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。

1.6　qPCR反應(yīng)

1.6.1qPCR體系和程序反應(yīng)體系總體積為20 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析。

1.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將cDNA樣本5倍稀釋后，進(jìn)行2倍梯度稀釋獲得5個(gè)濃度梯度(1、1/2、1/4、1/8、1/16)的cDNA樣品。用這些cDNA作為模板對(duì)目的基因和持家基因進(jìn)行熒光定量PCR，以濃度梯度的對(duì)數(shù)值(10為底數(shù))為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)所得Ct值為縱坐標(biāo)，繪制目的基因和持家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3qPCR檢測(cè)qPCR檢測(cè)利用Roche Light CyclerRR480Ⅱ型熒光定量PCR儀進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.7　基因分型

對(duì)FGF7基因g.57842893C>T位點(diǎn)在不同產(chǎn)羔數(shù)的綿羊品種中進(jìn)行分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)[25-26]對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)。分型樣品選擇：總共760只羊，包括有產(chǎn)羔數(shù)記錄的小尾寒羊380只，灘羊80只，蘇尼特羊100只，薩福克羊39只，杜泊羊30只，草原型藏羊131只，其中小尾寒羊?yàn)槎喔崞贩N，其它都是單羔品種。分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA濃度為40～80 ng·μL-1。

1.8　數(shù)據(jù)分析

熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，用SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同組別之間相對(duì)表達(dá)量差異以及不同基因型與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行分析，采用一般線性模型中單因素方差分析的最小顯著差異(Least significant difference, LSD)法進(jìn)行分析。

2　結(jié)　果

2.1　總RNA提取與cDNA合成

利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明,RNA完整性良好，28S條帶亮度大于18S，且二者均無(wú)明顯降解(圖1)，以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對(duì)FGF7和β-actin進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的FGF7和β-actin引物擴(kuò)增效果良好(圖2)，目的片段與預(yù)期的197和97 bp一致，且條帶單一，可以用于后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。

圖1　RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1　Agrose gel electrophoresis of the RNA

2.2　FGF 7基因在不同綿羊品種各組織中的sqRT-PCR檢測(cè)

利用sqRT-PCR技術(shù)對(duì)FGF7和β-actin在小尾寒羊和蘇尼特羊心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺、卵巢、輸卵管、子宮體、子宮角、瘤胃、大腸、小腸以及腎脂共19個(gè)組織中的表達(dá)進(jìn)行了研究，F(xiàn)GF7和β-actin引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為197和97 bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2表明，無(wú)論是多羔小尾寒羊還是單羔蘇尼特羊，F(xiàn)GF7基因均在心和肺中高表達(dá)，其次在多羔小尾寒羊的脾、甲狀腺、卵巢、輸卵管以及腎脂中表達(dá)量較高，在單羔蘇尼特羊垂體、卵巢、輸卵管以及大腸中表達(dá)量較高，在兩個(gè)品種其他各組織中表達(dá)量相對(duì)較低。

M.DL2000 DNA marker；1～19.心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺、卵巢、輸卵管、子宮體、子宮角、瘤胃、大腸、小腸以及腎脂 M.DL2000 DNA marker；1-19.Heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, adrenal gland, thyroid, ovary, oviduct, uterus body, uterine horn, rumen, colon, small intestine and kidney fat圖2　FGF 7和β-actin在小尾寒羊(A)和蘇尼特羊(B)19個(gè)組織中的半定量RT-PCR檢測(cè)Fig.2　sqRT-PCR of FGF 7 and β-actin in 19 tissues of Small Tail Han sheep(A) and Sunite sheep(B)

2.3　FGF 7基因組織表達(dá)分析

2.3.1FGF7基因在小尾寒羊和蘇尼特羊各組織間的表達(dá)利用qPCR技術(shù)對(duì)FGF7基因在多羔小尾寒羊和單羔蘇尼特羊大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮體以及子宮角8個(gè)重要繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)進(jìn)行了比較研究，結(jié)果見(jiàn)圖3。品種間比較發(fā)現(xiàn)，除了子宮體以外，F(xiàn)GF7基因在多羔小尾寒羊各組織中的表達(dá)量高于單羔蘇尼特羊(P>0.05)，但僅在小腦組織中的表達(dá)量達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)。

相同組織中的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Different letters in the same tissue mean significant difference (P<0.05), the same as below圖3　FGF 7基因在小尾寒羊和蘇尼特羊8個(gè)繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)Fig.3　Expression of FGF 7 gene in 8 reproductive tissues in Small Tail Han sheep and Sunite sheep

2.3.2FGF7基因在小尾寒羊FecB不同基因型間的表達(dá)利用qPCR技術(shù)對(duì)FGF7基因在多羔小尾寒羊FecB不同基因型個(gè)體大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮體以及子宮角8個(gè)重要繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)進(jìn)行了比較研究，結(jié)果見(jiàn)圖4。小尾寒羊品種內(nèi)(FecB3種基因型)qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7在B+型小尾寒羊卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于BB和++型(P<0.05)，在B+型小尾寒羊子宮體中的表達(dá)量顯著低于BB和++型(P<0.05)，其整體表達(dá)并無(wú)明顯規(guī)律。

圖4　FGF 7基因在FecB不同基因型小尾寒羊各組織中的表達(dá)Fig.4　Expression of FGF 7 gene in each tissue in Small Tail Han sheep with different genotypes of FecB

2.4　FGF 7基因多態(tài)性分析

通過(guò)分型發(fā)現(xiàn)g.57842893C>T位點(diǎn)在單、多羔品種中共存在3種基因型，分別是CC、CT和TT，見(jiàn)圖5。根據(jù)分型結(jié)果，對(duì)g.57842893C>T位點(diǎn)在單、多羔品種中的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表2)，并用卡方檢驗(yàn)驗(yàn)證了單、多羔綿羊品種間的基因型頻率和等位基因頻率之間的差異。從表2可知，g.57842893C>T位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在單、多羔品種間差異均達(dá)到顯著水平(P≤0.05)，且無(wú)論在單羔還是多羔品種中，CC均是優(yōu)勢(shì)基因型，C均是優(yōu)勢(shì)等位基因。

對(duì)g.57842893C>T位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算了該位點(diǎn)在各群體中的多肽信息含量、雜合度和有效等位基因數(shù)，并用卡方檢驗(yàn)檢測(cè)該位點(diǎn)在各群體中的平衡狀態(tài)，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，g.57842893C>T位點(diǎn)在蘇尼特羊、薩福克羊和杜泊羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.250.05)，而在小尾寒羊、灘羊和草原型藏羊中則處于不平衡狀態(tài)。

圖5　FGF 7基因g.57842893C>T位點(diǎn)分型結(jié)果Fig.5　Genotyping result of g.57842893C>T in FGF 7 gene

表2FGF7基因g.57842893C>T位點(diǎn)在單、多羔綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

Table2Genotypeandallelefrequenciesofg.57842893C>TintheFGF7geneinuniparousandmultiparoussheepbreeds

基因型Genotype多羔中基因型頻率/%Genotypefrequencyinmultiparoussheep單羔中基因型頻率/%Genotypefrequencyinuniparoussheep卡方檢驗(yàn)(P值)χ2test(Pvalue)等位基因Allele多羔中等位基因頻率/%Allelefrequencyinmultiparoussheep單羔中等位基因頻率/%Allelefrequencyinuniparoussheep卡方檢驗(yàn)(P值)χ2test(Pvalue)CC0.780.810.05C0.840.890.03CT0.130.14T0.160.11TT0.090.05

P≤0.05表示差異顯著

P≤0.05 indicates the significant difference

2.5　FGF 7基因g.57842893C>T位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

將g.57842893C>T位點(diǎn)分別與小尾寒羊第1胎、第2胎和第3胎產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知，g.57842893C>T位點(diǎn)不同基因型與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間并無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)，但從整體產(chǎn)羔水平來(lái)說(shuō)，CC型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)>TT型，CT型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)則不是很穩(wěn)定。

表3FGF7基因g.57842893C>T位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

Table3Populationgeneticanalysisofg.57842893C>TinFGF7genein6sheepbreeds

品種Breed基因型頻率/%Genotypefrequency等位基因頻率/%AllelefrequencyCCCTTTCT多態(tài)信息含量PIC雜合度He有效等位基因數(shù)Ne卡方檢驗(yàn)(P值)χ2test(Pvalue)小尾寒羊SmallTailHansheep0.78(271)0.13(46)0.09(31)0.840.160.230.261.360.00灘羊Tansheep0.96(73)0.03(2)0.01(1)0.970.030.050.051.050.00蘇尼特羊Sunitesheep0.65(58)0.31(27)0.04(4)0.800.200.270.321.460.71薩福克羊Suffolksheep0.45(13)0.38(11)0.17(5)0.640.360.360.461.860.34杜泊羊Dorpersheep0.41(7)0.41(7)0.18(3)0.620.380.360.471.900.60草原型藏羊PrairieTibetansheep0.98(119)0.01(1)0.01(1)0.990.010.020.021.030.00

P>0.05表示位點(diǎn)在該品種中處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)

P>0.05 indicates the locus was under Hardy-Weinberg equilibrium

表4FGF7基因g.57842893C>T位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

Table4LeastsquaresmeanandstandarderroroflittersizeofSmallTailHansheepwithdifferentgenotypesofg.57842893C>TinFGF7gene

基因型Genotype第1胎樣本數(shù)No.ofthe1stparity第1胎產(chǎn)羔數(shù)Littersizeofthe1stparity第2胎樣本數(shù)No.ofthe2ndparity第2胎產(chǎn)羔數(shù)Littersizeofthe2ndparity第3胎樣本數(shù)No.ofthe3rdparity第3胎產(chǎn)羔數(shù)Littersizeofthe3rdparityCC2442.14±0.052672.27±0.05962.92±0.10CT422.11±0.12452.20±0.13142.57±0.27TT262.04±0.15312.13±0.15102.90±0.33

3　討　論

3.1　FGF 7基因表達(dá)分析

本研究通過(guò)sqRT-PCR對(duì)多羔小尾寒羊和單羔蘇尼特羊19種組織FGF7基因表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該基因呈現(xiàn)為廣譜表達(dá)，在心和肺中高表達(dá)，這可能是因?yàn)镕GF7基因與綿羊的高原適應(yīng)性有關(guān)，高原上低壓缺氧的環(huán)境導(dǎo)致其必須增強(qiáng)心肺功能以更好地適應(yīng)環(huán)境[27]。另外，F(xiàn)GF7基因在多羔小尾寒羊卵巢組織中的表達(dá)量高于單羔蘇尼特羊，提示FGF7可能確實(shí)在卵巢發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，推測(cè)其表達(dá)量的變化可能會(huì)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)產(chǎn)生影響。因此，通過(guò)qPCR試驗(yàn)對(duì)筆者的假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。

qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7基因在多羔小尾寒羊各組織中的表達(dá)量趨勢(shì)基本都高于單羔蘇尼特羊，尤其是在多羔小尾寒羊HPGA各組織中的表達(dá)量均高于單羔蘇尼特羊，HPGA是控制哺乳動(dòng)物性激素分泌的最重要的系統(tǒng)[28-29]，其中下丘腦和垂體是哺乳動(dòng)物生殖內(nèi)分泌活動(dòng)的控制中心，而卵巢又是雌性動(dòng)物最重要的生殖器官，是卵子生成及多種生殖激素(如雌激素、孕激素)等分泌的場(chǎng)所，對(duì)雌性動(dòng)物的生殖能力有決定性的影響。FGF7基因在HPGA軸高表達(dá)，這與半定量RT-PCR結(jié)果顯示其在卵巢中表達(dá)量較高相吻合，也進(jìn)一步印證了筆者的推測(cè)，猜測(cè)其可能正是通過(guò)上調(diào)其在多羔小尾寒羊繁殖相關(guān)組織尤其是HPGA中的表達(dá)從而促進(jìn)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，該基因表達(dá)量升高使得小尾寒羊排卵數(shù)增加，進(jìn)而使產(chǎn)羔數(shù)得到提高。而FGF7在小尾寒羊FecB不同基因型中的表達(dá)并無(wú)明顯規(guī)律，且與單、多羔品種間的趨勢(shì)并不一致，猜測(cè)其表達(dá)可能受到FecB信號(hào)通路的影響。鑒于小尾寒羊++型樣品缺乏，目前無(wú)法比較++型單羔和多羔之間FGF7基因表達(dá)量的差異，且FecB基因?qū)е戮d羊排卵數(shù)增加的機(jī)制目前并不明確，這些都還有待于進(jìn)一步研究。

3.2　FGF 7基因與綿羊繁殖性狀之間的關(guān)系

群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF7基因g.57842893C>T位點(diǎn)在蘇尼特羊、薩福克羊和杜泊羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25T位點(diǎn)在小尾寒羊、灘羊和草原型藏羊中則處于非哈代溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)，可能是因?yàn)樽匀贿x擇或人工選擇對(duì)該位點(diǎn)分布影響較大，也可能與選擇的羊品種數(shù)量較少有關(guān)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7基因g.57842893C>T位點(diǎn)不同基因型與小尾寒羊第1、2以及第3胎產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)，其中CC型各胎產(chǎn)羔數(shù)均高于TT型，推測(cè)該位點(diǎn)突變?cè)谝欢ǔ潭壬辖档土诵∥埠虻漠a(chǎn)羔能力。

4　結(jié)　論

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF7在綿羊繁殖相關(guān)組織中呈中等豐度表達(dá)，且在多羔小尾寒羊各組織中的表達(dá)均高于單羔蘇尼特羊(P>0.05)，推測(cè)FGF7基因的表達(dá)水平與綿羊產(chǎn)羔數(shù)可能存在一定程度的正相關(guān)，但它在小尾寒羊FecB不同基因型之間的表達(dá)無(wú)明顯規(guī)律。本研究初步表明：FGF7雖然可能不是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)鍵基因，但g.57842893C>T位點(diǎn)對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的選育具有一定的指導(dǎo)意義。

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