檢測兔出血癥病毒抗體膠體金試紙條的研制及初步應用

魏后軍，范志宇，王　芳，宋艷華，胡　波，仇汝龍，陳萌萌，徐為中，薛家賓

(江蘇省農業科學院獸醫研究所·農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室· 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014)

兔病毒性出血癥(RHD)，俗稱“兔瘟”，是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種高度致死性、急性敗血性傳染病，該病發病率、病死率極高，給養兔業造成極大經濟損失[1]。目前，我國主要通過疫苗接種來預防和控制兔瘟。體液免疫應答在兔瘟的感染及免疫中起到重要的作用。通過檢測特異性抗體的應答能診斷RHDV的感染。檢測免疫后或恢復期動物體內特異性抗體滴度可預測家兔抵抗RHDV感染的能力。因此，建立能快速、準確檢測RHDV抗體水平的方法顯得尤為重要。目前，檢測兔出血癥病毒抗體主要使用血凝抑制試驗(HI)[2]、間接ELISA和競爭ELISA[3]，有研究者報道血清血凝抑制效價為3log2以上的家兔，能抵抗RHDV強毒攻擊[4]。但這些方法步驟繁瑣，需要專業的設備和技術人員，不適合基層推廣。膠體金試紙條在畜禽疾病監測方面得到廣泛的研究和應用[5-8]，具有快速、簡便、準確的特點，非常適合臨床應用。

衣殼蛋白VP60是RHDV的主要結構蛋白，重組桿狀病毒表達系統能夠高效表達VP60，并且能夠在體外自聚成形態學以及抗原性上與天然 RHDV病毒粒子幾乎無差異的病毒樣顆粒[9-10]。本實驗室已經建立了以重組VP60蛋白作為包被抗原檢測RHDV抗體的ELISA方法，具有較高的特異性、敏感性等，同時避免了直接包被病毒存在的散毒風險[11]；目前還未見以病毒樣顆粒作為金標抗原研制試紙條的報道。一個金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)分子可以和多個IgG結合，與兔IgG有較強的結合能力[12-13]。因此，本研究用純化的VP60蛋白作為金標抗原，具有較好的特異性，并具有良好的生物安全性；在NC膜上C線、T線分別包被抗RHDV VP60單克隆抗體A3C、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)；以檢測HI效價為3log2的樣品，T線、C線出現相同顏色深度條帶為標準，優化反應條件，研制出可以根據T線、C線顯色情況反映兔出血癥病毒抗體水平的膠體金試紙條。該試紙條用血清作為樣本即可進行抗體檢測，為兔病毒性出血癥流行病學調查和疫苗免疫效果評價提供了一種快速、便捷的方法。

1　材料與方法

1.1　毒株及細胞

抗RHDV VP60 單克隆抗體A3C[5]和桿狀病毒表達系統表達的重組VP60蛋白[9]由本實驗室制備[14-15]。

1.2　血清

兔出血癥病毒強陽性(HI效價大于等于4log2)、陽性(HI效價為3log2)、弱陽性(HI效價為1log2或2log2)血清和兔多殺性巴氏桿菌(Pm)、兔支氣管敗血波氏桿菌(Bb)、兔A型產氣莢膜梭菌(CpA)的陽性血清均由本實驗制備；陰性血清來自邳州市東方養殖有限公司的SPF兔。

1.3　主要試劑

金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)購自北京博爾西科技有限公司；不含IgG的牛血清白蛋白(BSA)購自上海翊圣生物科技有限公司；PEG 20000購自Biosharp公司；氯金酸、檸檬酸三鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。兔出血癥基因工程疫苗[9]由本實驗室制備，商品化兔出血癥組織滅活疫苗購自南京天邦生物科技有限公司。

1.4　試紙條材料

硝酸纖維素膜購自Millipore公司，樣品墊、金標墊、吸水紙、支撐板、塑料卡購自上海捷寧生物科技有限公司。

1.5　膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉法制備直徑20 nm的膠體金顆粒[8]，用透射電鏡觀察，2～8 ℃保存、備用。

1.6　膠體金試紙條的制備

1.6.1膠體金標記VP60最適pH值的選擇取9支試管，每支試管加入1 mL膠體金溶液，分別加入0.1 mol·L-1K2CO3溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9 μL調節pH值，各試管滴加50 μL 1 mg·mL-1的VP60，混勻后作用30 min，加入10%NaCl 100 μL，混勻室溫放置30 min后，記錄溶液保持紅色的最低0.1 mol·L-1K2CO3添加量，并用精密pH試紙檢測該溶液的pH值，即為膠體金標記VP60最適pH值。

1.6.2膠體金標記VP60最適蛋白量的選擇取9支試管，每支試管加入1 mL調節到最適pH值的膠體金溶液，分別加入1 mg·mL-1的VP60 5、10、15、20、25、30、35、40、45 μL，混勻后作用30 min，加入10%NaCl 100 μL，混勻室溫放置30 min后，溶液保持紅色的最低VP60的添加量，在此基礎上增加20%即為最適標記蛋白量。

1.6.3膠體金標記蛋白向調至最佳pH的膠體金溶液中，緩慢加入最適蛋白量的VP60，室溫攪拌30 min；加入10% PEG20000 至終濃度1%作為穩定劑；將上述膠體金溶液經離心法純化[8]，加入重懸液(含0.1%PEG20000的0.002 mol·L-1硼酸緩沖液)重懸至原體積的1/10，置2～8 ℃備用。

1.6.4試紙條的組裝依次把吸水墊、金標墊和樣品墊粘貼到NC膜上，各墊之間有1 mm重疊，用切條機切成4 mm寬的試紙條，裝入塑料卡，置于鋁箔袋中，加干燥劑密封。

1.7　試紙條條件優化

1.7.1金標VP60溶液稀釋度的選擇將金標溶液用重懸液按一定比例稀釋，噴在金標墊上，溫箱烘干；NC膜C線、T線分別包被過量的A3C、SPA；組裝成試紙條。用試紙條分別檢測100倍稀釋的強陽性、陽性、弱陽性血清，選擇的稀釋度滿足條件：檢測強陽性血清時，T線顏色比C線深；陽性血清時，T線、C線顏色相同；檢測弱陽性血清時，T線顏色比C線淺。

1.7.2T線、C線的濃度的選擇以T線SPA，C線 A3C不同蛋白濃度做點陣，與包被最佳稀釋度金標溶液的金標墊等組裝成試紙條。用試紙條分別檢測100倍稀釋的強陽性、陽性、弱陽性血清，T線、C線濃度的選擇滿足條件：檢測強陽性血清時，T線顏色比C線深；陽性血清時，T線、C線顏色相同；檢測弱陽性血清時，T線顏色比C線淺。

1.8　敏感性

強陽性血清(HI效價為8log2)用生理鹽水依次倍比稀釋1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512，即HI效價分別為7log2、6log2、5log2、4log2、3log2、2log2、1log2、0log2、-1log2，將生理鹽水稀釋100倍的以上樣品和不稀釋的強陽性血清，吸取100 μL滴加到試紙條加樣孔中，10 min判斷結果。

1.9　特異性

將兔多殺性巴氏桿菌(Pm)、兔支氣管敗血波氏桿菌(Bb)、兔A型產氣莢膜梭菌(CpA)的陽性血清用生理鹽水100倍稀釋，吸取100 μL滴加到試紙條加樣孔中，10 min判斷結果。

1.10　重復性

從3批次試紙條中各抽取40條，檢測強陽性、陽性、弱陽性、陰性血清樣品，觀察試紙條檢測結果。

1.11　穩定性

試紙條2～8 ℃保存，每隔一個月抽取試紙條檢測強陽性、陽性、弱陽性、陰性血清樣品，觀察試紙條檢測結果。

1.12　符合率

取已測HI效價的強陽性血清、陽性血清、弱陽性血清各80份，陰性血清20份，用試紙條檢測并計算與血凝抑制方法的符合率。

1.13　試紙條的初步應用

兔出血癥基因工程疫苗、兔出血癥組織滅活疫苗、PBS各1 mL分別皮下注射5只實驗兔；在免疫后0、3、7、14、21 d采血，用試紙條檢測血清，比較兩種疫苗的抗體產生期。

2　結　果

2.1　膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉法制備膠體金顆粒，通過透射電鏡掃描觀察，膠體金分布均勻、大小均一；隨機取50個膠體金顆粒，測量其直徑，粒徑為(20.6±2.0)nm。

2.2　膠體金標記VP60最適pH值

膠體金標記VP60最適pH值選擇試驗結果顯示，每毫升膠體金溶液中最少添加6 μL 0.1 mol·L-1K2CO3，溶液仍保持紅色，此時溶液pH值為7.5，即為標記VP60最適pH值。

2.3　膠體金標記VP60最適蛋白量

膠體金標記VP60最適蛋白量的選擇試驗結果顯示，每毫升膠體金溶液中最少添加15 μL 1 mg·mL-1的VP60能使溶液保持紅色，在此基礎上增加20%，即18 μL 1 mg·mL-1的VP60為最適蛋白量。

2.4　試紙條條件優化

金標VP60溶液用重懸液按1∶4稀釋；T線SPA質量濃度為0.6 mg·mL-1，C線A3C質量濃度為2.0 mg·mL-1。優化條件后制備的試紙條檢測強陽性血清(HI效價大于等于4log2)時，T線顏色比C線深；陽性血清(HI效價為3log2)時，T線、C線顏色相同；檢測弱陽性血清(HI效價為1log2或2log2)時，T線顏色比C線淺(圖1)。

圖1　經優化試紙條的檢測結果Fig.1　The detection result of optimized strips

2.5　敏感性

試紙條敏感性試驗結果顯示，試紙條可以直接檢測強陽性血清，最低可以檢測到經生理鹽水100倍稀釋的1log2樣品，說明試紙條檢測范圍為：原液至1∶12 800；試紙條在檢測100倍稀釋的樣品時，敏感性與血凝抑制方法相同。

2.6　結果判定

待檢血清用生理鹽水100倍稀釋后，吸取100 μL

滴加到加樣孔中，10 min判斷結果。T線顏色比C線深判定為強陽性；T線、C線顏色相同判定為陽性；T線顏色比C線淺判定為弱陽性；T線不顯色、C線顯色判定為陰性；C線不顯色則試紙條無效。

2.7　特異性

試紙條特異性試驗顯示，兔多殺性巴氏桿菌(Pm)、兔支氣管敗血波氏桿菌(Bb)、兔A型產氣莢膜梭菌(CpA)的陽性血清及陰性(SPF)血清結果均為陰性，而RHDV陽性血清檢測結果為陽性，說明該試紙條特異性良好。

2.8　重復性、穩定性

3批次試紙條檢測強陽性、陽性、弱陽性、陰性血清結果一致。試紙條2～8 ℃保存6個月，檢測強陽性、陽性、弱陽性、陰性血清結果不變。

2.9　符合率

膠體金試紙條檢測強陽性、陽性、弱陽性、陰性血清的結果與血凝抑制試驗的符合率分別為93.75%、88.75%、91.25%、95.00%，260份樣品中，兩種檢測方法結果相同的共75+71+73+19=238份，總的符合率為91.54%(表1)。

表1膠體金試紙條與血凝抑制試驗比較

Table1ComparisonofcolloidalgoldteststripwithHItest

血清Serum數目Number試紙條檢測結果Stripdetectionresults強陽性Strongposition陽性Position弱陽性Weakposition陰性Negative符合率/%Coincidence強陽性Strongpositive807550093.75陽性positive806713088.75弱陽性Weakpositive800373491.25陰性Negative200011995.00

2.10　試紙條的初步應用

試紙條檢測免疫兔血清中的抗體水平，基因工程苗免疫后0、3 d 5只均陰性，7 d 2只弱陽性、3只陰性，14 d 1只弱陽性、3只陽性、1只強陽性，21 d 4只強陽性、1只陽性；組織滅活苗免疫后0、3、7 d 5只均陰性，14 d 4只弱陽性、1只陰性，21 d 4只弱陽性、1只陽性；PBS免疫后至21 d均未檢測到抗體。

3　討　論

3.1兔病毒性出血癥感染率、死亡率高，給養殖業造成巨大的經濟損失。目前主要通過接種疫苗來控制與預防該病。因此，能快速、準確檢測疫苗免疫后抗體水平的方法顯得尤為重要。檢測方法主要有血凝抑制試驗和ELISA方法[2,11]，但這些方法耗時長，操作繁瑣。本試驗研制的膠體金試紙條，加樣后10 min得到結果，根據顯色情況就能判定血清中抗體水平。兔出血癥病毒抗體為陽性或強陽性的兔，能抵抗RHDV強毒攻擊，弱陽性兔部分抵抗RHDV強毒攻擊，陰性兔不能抵抗RHDV強毒攻擊[4]，因此，試紙條檢測結果為陽性或強陽性時，說明兔不需加強免疫；試紙條檢測結果為弱陽性或陰性時，需加強免疫。

3.2為防止試紙條檢測不稀釋的強陽性血清時，金標VP60被血清中過量的特異性抗體結合，導致沒有多余未標記的金標VP60和C線上的蛋白反應，出現C線條帶極淡或沒有的現象，制備試紙條時，C線包被的單抗與VP60的結合應不被多抗阻斷，即VP60與多抗結合后仍能結合單抗。因此在選擇單抗時，我們用阻斷ELISA方法[3]，以VP60包被ELISA板，用兔抗VP60多抗阻斷單抗與VP60反應，同時間接ELISA方法[11]檢測單抗效價。結果顯示，實驗室制備的4株單抗均未被阻斷，可用于包被C線，但A3C效價較高，因此選擇A3C作為質控線包被蛋白。

3.3在臨床使用試紙條時，檢測全血會比檢測血清更加便捷。普通樣品墊不能攔截紅細胞，會導致NC膜紅色背景，影響結果判斷。本研究使用濾血墊作為樣品墊，可以有效地攔截紅細胞。全血中約含50%的血清[16]，因此檢測全血樣品時，需用生理鹽水50倍稀釋后再檢測。

4　結　論

成功建立檢測兔出血癥病毒抗體的膠體金試紙條，可通過試紙條顯色結果判定血清中抗體水平，可用于兔病毒性出血癥的流行病學調查和抗體水平監測。

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