奶牛乳腺上皮細胞中SCAP和SREBP1蛋白調控SCD基因表達的作用研究

韓立強，孫　宇，付　彤，廉紅霞，高騰云

(河南農業大學牧醫工程學院/農業部動物生化與營養重點實驗室，鄭州 450002)

固醇調節元件結合蛋白(SREBPs)是調控細胞內膽固醇和甘油三酯合成，維持脂肪穩態的主要調控因子[1-2]。固醇調節元件結合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein，SCAP)是SREBP的結合蛋白。哺乳動物SCAP蛋白一般由跨膜螺旋(TM)和羧基(C)末端組成，其中SCAP的TM構成了一個固醇敏感結構域，C末端結構域與SREBP前體在內質網膜形成復合物[3-4]。在細胞內膽固醇減少后，SREBP-SCAP復合物從內質網轉移到高爾基體，隨后SREBP前體蛋白的N末端發生蛋白酶水解，生成的SREBP片段進入細胞核調控靶基因轉錄，而SREBP前體蛋白的C末端通過未知機制從SCAP中移除，SCAP蛋白再從高爾基體回到內質網，然后與新合成的SREBP前體蛋白循環結合[5]。

已經有多個研究發現，SCAP-SREBP是調控固醇和脂肪代謝的關鍵信號通路[6]，介導了細胞內cAMP等多種分子對機體脂肪代謝的調節[7-8]。對反芻動物的研究發現，奶牛乳腺作為分泌乳脂的主要器官，胰島素及一些信號分子能夠調控乳腺上皮細胞的SREBP基因表達[9-10]。本實驗室前期通過構建奶牛SREBP表達載體及硬脂酰輔酶A 去飽和酶基因(SCD)啟動子載體發現，在奶牛乳腺上皮細胞中SREBP1可以促進SCD基因的轉錄[11-12]，但在SCAP作用下對SREBP1調控SCD基因轉錄的影響還不清楚。

本研究通過在奶牛乳腺上皮細胞轉染SCD啟動子載體，共轉染SCAP和SREBP1真核表達載體，分析對SCD啟動子活性及其基因表達的影響，為闡明奶牛乳腺細胞中SCAP-SREBP1通路對于脂肪代謝基因的轉錄調控機制打下基礎。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

奶牛乳腺上皮細胞由實驗室保存，奶牛SCAP真核表達載體(pcDNA3.1-SCAP)、SREBP1真核表達載體(pcDNA3.1-SREBP1)、奶牛pGL3-SCD2/SCD3啟動子載體為實驗室前期構建的SCD基因啟動子熒光素酶報告基因表達載體[11](序列長度分別為381和417 bp，其中奶牛pGL3-SCD3含有SRE元件，結構見圖1) 由實驗室構建，熒光定量PCR儀(Eppendorf，德國)，Opti-mem無血清培養基(Gibco，美國)，DMEM培養基(Hyclone)，Lipofectamine3000(Thermo，美國)，雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega，美國)，SYBR Green(百泰克)，c-MYC Antibody(9E10)(Santa Cruz，美國)，Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)(Invitrogen,美國)，二氧化碳培養箱(Sanyo，日本)，Fluroskan Ascent FL熒光和化學發光檢測儀(Thermo，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 5 PASCAL，德國)。

圖1　奶牛pGL3-SCD2/SCD3啟動子的結構Fig.1　Structure of dairy pGL3-SCD2/SCD3 promoters

1.2　方　法

1.2.1雙熒光素酶報告基因系統檢測SCD啟動子活性將奶牛乳腺上皮細胞接種于24孔板培養，放入5% CO2、37 ℃的培養箱中進行培養。將構建好的pGL3-SCD2和pGL3-SCD3啟動子用Lipofectamine3000轉染至細胞，進行不同的轉染處理分組：對照組(轉染1.0 μg pcDNA3.1質粒)，SCAP組(轉染1.0 μg SCAP質粒)，SREBP1組(轉染1.0 μg SREBP1質粒)，SCAP+SREBP1組(轉染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質粒)，作用24 h后收集細胞加入裂解液，同時轉染內參海腎熒光素酶質粒，采用熒光和化學發光檢測儀檢測熒光素酶活性并進行分析，相對啟動子熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.2熒光素酶活性檢測SCAP與SCD啟動子的量效關系乳腺上皮細胞接種于24孔板，將pGL3-SCD3質粒瞬時轉染細胞，進行不同的轉染處理分組：對照組(2.0 μg pcDNA3.1)，SREBP1組(1.0 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1)，SCAP(0.1)組(0.1 μg SCAP+0.9 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1)，SCAP(0.5)組(0.5 μg SCAP+0.5 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1),SCAP(1.0)組(1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質粒)，作用24 h后，收集細胞進行啟動子活性檢測，采用回歸分析檢測SCAP質粒含量與SCD基因啟動子活性之間的量效關系。

1.2.3免疫熒光觀察SREBP1蛋白在細胞核的表達在24 孔板中加入細胞爬片后接種培養乳腺上皮細胞，進行不同的轉染處理分組：對照組(Control，轉染1.0 μg pcDNA3.1 +1.0 μg SREBP1)，SCAP組(SCAP，轉染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質粒)，培養12 h后用PBS漂洗3次，多聚甲醛固定后用PBS漂洗，室溫脫脂奶粉封閉2 h后，c-myc(9E10)一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后用綠色熒光標記的驢抗鼠IgG二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h， 進行免疫熒光標記，PBS漂洗后，DAPI復染細胞核，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核中SREBP1的熒光表達情況。

1.2.4熒光定量PCR檢測SCD基因mRNA的表達將乳腺上皮細胞經過胰酶消化后分散到12孔板中培養，進行不同的轉染處理分組：對照組(轉

染1.0 μg pcDNA3.1)，SCAP組(轉染1.0 μg SCAP質粒)，SREBP1組(轉染1.0 μg SREBP1質粒)，SCAP+SREBP1組(轉染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質粒)，培養48 h后Trizol提取RNA，反轉錄成cDNA。在NCBI上搜索奶牛SCD基因序列(NM_173959)，并用Primer3 Plus設計熒光定量引物(表1)，以cDNA為模板，利用SYBR Green擴增熒光定量PCR檢測SCD基因mRNA的表達。同時以牛UXT基因(NM_001037471)作為內參基因，利用相對定量法計算不同處理對SCD基因mRNA表達的倍數差異。

表1熒光定量PCR引物

Table1Primersusedforquantitativereal-timePCRanalysis

引物Primer序列(5'-3')Sequence產物長度/bpSizeSCD-FCGACGTGGCTTTTTCTTCTC158SCD-RCACAACAACAGGACACCAGGUXT-FCAGCTGGCCAAATACCTTCAA125UXT-RGTGTCTGGGACCACTGTGTCAA

1.2.5數據統計試驗數據采用SPSS10.0軟件進行統計學分析，Sigmaplot作圖，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2　結　果

2.1　奶牛乳腺上皮細胞中SCAP對SCD啟動子轉錄的影響

由圖2可知，在乳腺上皮細胞中轉染 pGL3-SCD2啟動子后，與對照組相比，SREBP1組和SCAP組的SCD2啟動子活性值有所下降，而SCAP+SREBP1組SCD2啟動子活性值顯著下降(P<0.05)。在轉染 pGL3-SCD3啟動子的乳腺上皮細胞中，與對照組相比，SCAP組對啟動子活性無顯著影響，SREBP1組啟動子活性值極顯著升高到114.53 (P<0.01)，SCAP+SREBP1組啟動子活性值極顯著升高到192.81(P<0.001)，并且SCAP+SREBP1組與SREBP1組之間SCD3啟動子活性值也達到極顯著差異(P<0.01)。

圖2　SCAP對SCD基因啟動子活性的影響Fig.2　Effect of SCAP on promoter activity of SCD gene

2.2　奶牛乳腺上皮細胞中SCAP與SCD啟動子轉錄的量效關系

由圖3可知，與對照組轉染pcDNA3.1相比，轉染SREBP1組啟動子活性值為55.66 (P<0.01)，隨著SCAP質粒含量的增加，SCD基因啟動子活性值從64.41(SCAP= 0.1 μg)增加到169.07(SCAP=1.0 μg)，回歸分析發現，SCAP質粒濃度與SCD基因啟動子活性呈極顯著的量效關系(P<0.01)。

2.3　SCAP對SREBP1蛋白在奶牛乳腺上皮細胞核表達的影響

由圖4可知，對照組乳腺上皮細胞核中只有少量SREBP1表達綠色熒光，與DAPI染的細胞核藍色融合(Merge)后主要呈現藍色。轉染SCAP組細胞核中SREBP1綠色熒光表達明顯增多，與DAPI重疊后呈現出融合的青光。

2.4　SCAP及SREBP1蛋白對奶牛乳腺上皮細胞中SCD基因mRNA表達的影響

由圖5可知，與對照組相比，SCAP組細胞中SCD基因的表達量無明顯變化。SREBP1組顯著上調1.23倍(P<0.05)，SCAP+SREBP1組顯著上調1.54倍(P<0.05)，而SREBP1組與SCAP+SREBP1組SCD基因表達相比差異不顯著(P=0.21)。

Control. 2.0 μg pcDNA3.1;SREBP1. 1.0 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1;SCAP(0.1). 0.1 μg SCAP+0.9 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1；SCAP(0.5). 0.5 μg SCAP+0.5 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1；SCAP(1.0). 1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1圖3　SCAP調控SCD基因啟動子活性的量效關系Fig.3　Dose-response relationship between SCAP and SCD promoter activity

SCAP(-) . 1.0 μg pcDNA3.1 +1.0 μg SREBP1;SCAP(+). 1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1圖4　SCAP對SREBP1核蛋白表達的影響 600×Fig.4　Effect of SCAP on the nuclear SREBP1 expression 600×

圖5　SCAP與SREBP1對乳腺上皮細胞SCD基因mRNA表達的影響Fig.5　Effects of SCAP and SREBP1 on mRNA expression of SCD in mammary epithelial cells

3　討　論

SREBPs是一種調控脂代謝的轉錄因子，通過包含兩個跨膜序列的中心結構域錨定在內質網膜上，其N端結構域是堿性環-螺旋-亮氨酸拉鏈結構，能夠結合靶基因啟動子上的增強子序列以激活轉錄，這些增強子序列被稱為固醇應答元件(SRE)[13-14]。本研究前期構建的SCD基因啟動子序列，SCD3啟動子比SCD2啟動子多的36 bp片段中含有SRE序列(圖1)，轉染SREBP1后發現SCD3啟動子的活性顯著升高，這符合SREBP1能夠結合在基因啟動子SRE上促進轉錄的性質，其他研究也發現過表達SREBP能夠促進SCD基因的轉錄[15]。SREBP的蛋白活性受到多種分子的調控[16]，其中包括SCAP蛋白[17]。研究表明，采用siRNA沉默小鼠SCAP基因后發現其肝的SREBP信號通路及下游靶基因表達受到抑制[18]。本試驗在轉染SCAP+SREBP1質粒時發現，SCD3啟動子的活性比單獨轉染SREBP1的活性顯著升高，結合SCAP質粒的濃度與SCD3啟動子活性呈現出的量效關系，表明SCAP作為SREBP1的結合蛋白，能夠增強SREBP1促進SCD基因轉錄的作用。

SCAP作為SREBP的相互作用蛋白，其調控作用主要體現在SCAP能夠通過與SREBP結合轉運其到高爾基體進行水解，進一步釋放SREBP進入細胞核[19-20]。在SCAP基因敲除的MA10細胞中重新轉染SCAP質粒，能夠顯著增加核SREBP蛋白的表達[7]。本研究采用免疫熒光觀察發現，SCAP組的細胞核內有更多的SREBP1蛋白表達(圖4)，表明SCAP增強了SREBP1前體蛋白向核的轉運，相應的也會增加下游靶基因的轉錄，與本研究中SCD基因啟動子的結果相互印證(圖2、圖3)。C.M.Cheng等[21]通過免疫熒光發現，在葡萄糖刺激下增加細胞SCAP的表達，也能夠提高SREBP在細胞核的表達。SREBP1作為調控奶牛乳腺細胞中脂肪合成的主要轉錄因子[22]，在乳腺細胞中轉染SREBP能夠增加脂類基因的表達[23-24]。為進一步驗證SCAP及SREBP對SCD基因表達的作用，本研究在乳腺細胞中分別轉染這兩種質粒，結果發現，SREBP1能夠顯著上調乳腺細胞SCD基因的表達，這與在羊乳腺上皮細胞中的研究結果相一致[25]，同時發現，SCAP+SREBP1組也能夠顯著上調細胞中SCD基因的表達，并且其倍數高于SREBP1組。雖然SCAP+SREBP1與SREBP1組之間統計分析差異不顯著，但這一結果也佐證了SCAP能夠促進SREBP1對于SCD基因的調控作用。

X.Gong等[26]采用晶體衍射法發現，在裂殖酵母SCAP蛋白C端有7個WD重復序列形成的結構域，在與SREBP的C-端結合以促進SREBP前體蛋白轉運過程中發揮重要作用，因此進一步研究奶牛等反芻動物SCAP蛋白結構和功能的關系，對于闡明乳腺細胞脂肪合成調控機制具有重要意義。

4　結　論

本研究發現，SCAP可以通過增加SREBP1蛋白在細胞核中的表達，促進對SCD基因的轉錄激活作用，為深入闡明奶牛乳腺細胞中SCAP-SREBP1通路對乳脂肪合成的表達調控機制提供了理論基礎。

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2.4 兩組患兒瓣膜反流情況 對照組患兒術后新發瓣膜反流13例(32.5%)，主動脈瓣反流6例(15.0%)；觀察組術后新發瓣膜反流6例(14.6%)，主動脈瓣反流4例(9.8%)。兩組患兒新發瓣膜反流發生率對比差異有統計學意義(χ2=7.933，P<0.05)。

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