大球蓋菇菌種生產技術

于延申　任梓銘　王隆洋　王　月

（吉林省蔬菜花卉科學研究院　130033）

食用菌和其它農作物一樣，種子是保證高產、穩產、優質、抗病等的關鍵。而影響菌種質量關鍵因素：一是菌源；二是制種技術。大球蓋菇作為一種珍稀食用菌，其菌種質量的優劣是關系到球蓋菇栽培的命脈，育菌技術程度直接影響到育菌成品率，是決定產量大小、菇體品質好壞、商品價值高低的重要關鍵因素。

大球蓋菇目前生產上應用的品種主要是從國外引入的菌株，品種較少，各地由于氣候條件不同，也選育分離出一些的民間種源。如：黑龍江省倪淑君老師培育出“黑農球蓋菇1號”是比較適于北方寒地栽培的優良品種。吉林省到目前為止還沒有自己的品種。選擇了優良菌株只是走完了第一步，更關鍵的是掌握制種技術，嚴格按照操作規程操作，才能生產出優良的菌種，獲得好的栽培效果。

1　菌種制作設備

大球蓋菇菌種制作要有必需的設備，其中有接種、滅菌、培養、保藏等設備。這些設備必須達到設計的要求，以保證使用效果。

1.1接種設備

1.1.1接種箱：又稱無菌操作箱，是菌種擴繁轉接的設備。要求密閉性好，是對稱雙斜面箱式結構，斜面可以門式開啟，其上安裝透明玻璃，玻璃門平面同人的視線成135度夾角。接種箱兩側面各有兩個直徑15厘米的圓洞，兩洞中心距離40厘米，每個洞口裝有40厘米長的雙層布套袖，袖口有松緊帶，接種操作時，雙手經兩布套袖伸入箱內。箱內頂上安裝有40瓦紫外燈和日光燈各一個。

1.1.2接種室：又稱無菌操作室，面積一般6～8平方米，高2米，墻壁光滑，多為玻璃，地面平整光滑，有利于平整和消毒。接種室內有操作臺，臺上放置接種工具。接種室進口設一緩沖間，避免接種人員出入時門直接向外開，防止未經消毒的空氣將細菌帶入室內。緩沖間規格為1米×2米，緩沖間內備有已消毒的工作服、拖鞋、帽子和口罩等。接種室和緩沖間均為推拉門，可減緩開關門引起的空氣流動。接種室頂端安裝一空氣過濾機，可以抽出二氧化碳，并補充所需氧氣，降低室內溫度。接種室和緩沖間頂部各安裝一紫外燈，在接種前30分鐘開啟，對空氣中的懸浮微生物進行消毒和滅菌。

1.1.3超凈工作臺：最現代的接種設備。

1.2滅菌設備

滅菌設備主要包括高壓蒸汽滅菌鍋和常壓滅菌鍋，根據結構分為立式和臥式兩種。高壓蒸汽滅菌鍋滅菌溫度可達121℃（1.1千克/平方厘米）或126℃（1.5千克/平方厘米）左右，滅菌時間根據滅菌材料而定30分鐘到3小時不等。常壓滅菌鍋內溫度100～105℃，滅菌時間一般8～10小時。常壓滅菌注意事項如下：①菌種瓶或袋在鍋內擺放要合理，疊放最多5層，盡可能放入周轉筐內，滅菌效果好。②冷空氣一定要排放干凈后開始計時滅菌時間。③滅菌結束后，要趁熱及時搬出滅菌物。

1.3恒溫培養箱和培養室

1.3.1恒溫培養箱：恒溫培養箱是大球蓋菇母種和少量原種培養時必需的設備，箱內的溫度升降是由電子自動控溫儀器調節的。價格每臺3000元左右。

1.3.2培養室：培養室是用來培養大球蓋菇原種和栽培種的恒溫室，每個培養室面積20～50平方米。要求空氣流通、避光、入口處有緩沖間。

1.4菌種保藏室和化驗室

1.4.1菌種保藏室：菌種已經生產好不能及時投入生產時，要移出培養室入保藏室，要求保藏室通風干燥，有通風和降溫設備，避光，大球蓋菇在15～20℃的溫度下可以保藏25～30天，不會影響菌種的質量。

1.4.2化驗室：又稱準備室或工作室，是進行菌絲體顯微觀察、鑒定、孢子收集、組織分離、母種培養基制作等技術性較強的工作的地方，內有工作臺及恒溫培養箱、冰箱、顯微鏡等儀器、設備。

冰箱：存放母種，溫度0～5℃，保藏時間3個月，3個月后轉管培養后再繼續保藏。

顯微鏡：用來觀測和鑒定擔孢子和菌絲體的質量。

天平：用來稱量配制母種培養基中微量元素或配制基礎溶液的各種化學物質的儀器。按常用的天平分度值，應有1/100、1/1000和1/10000天平各一臺。

玻璃器皿：試管、培養皿、菌種瓶。試管主要用來培養母種，常用規格18毫米×180毫米、20毫米×200毫米；培養皿又稱玻璃平板，用作分離孢子和母種菌絲，常用的直徑規格10～12厘米；菌種瓶是用作培養原種、栽培種的容器，顏色可以白色和淺綠色，容量750毫升為佳。

其它用品：接種工具（接種針、接種環、接種鉤、接種鋤、接種鏟、接種匙、接種刀、解剖刀、剪刀、鋼鉤、鑷子、彈簧接種槍、接種槍）、酒精燈、吸管、量筒、漏斗、鐘罩、鍋、電爐或者電磁爐等。

1.5配料設備

主要指用于制作大球蓋菇原種和栽培種配料時所使用的基本設備，包括鍘草機、拌料機等。

鍘草機：用于粉碎大球蓋菇的草料，鍘草機切草長度可在2～10厘米范圍內調節，大球蓋菇一般要求草料長度3～5厘米。

拌料機：將大球蓋菇的母種和栽培種的培養料主料和輔料進行充分攪拌，最后達到均勻的機器。

1.6分裝設備

用于把培養基裝入瓶子或袋子中的設備。主要有：裝瓶機、裝袋機和裝瓶裝袋兩用機。

2　菌種培養基配方設計及其制作

2.1培養基

國內食用菌一般采取三級菌種生產體系，即母種-原種-栽培種；也有直接用母種接種栽培種的二級菌種生產體系。不管幾級菌種繁育體系，培養基配方設計和制作都是必須的。培養基是大球蓋菇菌絲生長繁殖的營養基質，不同的菌種所需要的培養基也不一樣。其培養基可分為以下幾種。

2.1.1第一種：天然培養基。天然培養基是指自然界中的動植物體或者其中一部分直接用來配制培養基。如麥粒、玉米粒、小米粒、馬鈴薯、胡蘿卜等均可直接利用。植物的副產品，如麩皮、米糠、豆餅、玉米粉、秸稈、糠殼等或者動植物體的加工品，如麥芽汁、酵母膏、牛肉膏等均屬于天然培養基，天然培養基資源豐富，價格低廉。

2.1.2第二種：合成培養基。合成培養基是由成分已知的有機物或無機物按一定比例配制而成的，如用作碳源的葡萄糖、蔗糖、淀粉等有機物；用作氮源的蛋白胨、酵母膏等有機物；用做礦物質的氯化鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等這些物質的成分結構都是已知的。按照科學的配方配制的培養基主要用作菌絲的鑒定及定向選育。

2.1.3第三種：半合成培養基。是在天然培養基中加入成分已經確定的物質配制而成，如在馬鈴薯培養基中加入葡萄糖、磷酸二氫鉀等物質配制而成的培養基。這類培養基在大球蓋菇生產中應用最為普遍，取材容易還能通過添加已知成分的物質起到專用作用。既能用于菇類生產，還可用于菌種篩選。

2.2母種培養基配方和制作

配方：①馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18～20克、水1000毫升、pH值自然。②馬鈴薯200克、蔗糖20克、瓊脂20克、磷酸二氫鉀3克、硫酸鎂2克、水1000毫升、pH值自然。③馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氫鉀3克、硫酸鎂2克、水1000毫升、pH值自然。④麥芽糖酵母瓊脂培養基（MAY）麥芽糖20克、蛋白胨1克、酵母1克、瓊脂18克、加水定容到1升。⑤馬鈴薯葡萄糖酵母瓊脂培養基（PDYA）馬鈴薯300克（加水1.5升，煮20分鐘，用濾汁）、豆胨1克、酵母2克、瓊脂18克、葡萄糖10克、加水定容至1升。⑥麥芽粉麥芽糖酵母瓊脂培養基（DMYA）麥芽糖10克、麥芽粉85克、酵母1克、瓊脂18克加水定容至1升。

制作:

①煮制：將馬鈴薯去皮稱取300克—切成小丁或者條狀—放入不銹鋼鍋中或者鋁鍋中—加水1500毫升—煮沸15～20分鐘—馬鈴薯熟而不爛—用4～6層紗布過濾—濾液補水至1升—加熱至沸—將瓊脂加入不斷攪動—待瓊脂溶化后再依次加入酵母、豆胨、葡萄糖等，保持煮成的容量為1升。

②分裝和滅菌：煮成的培養基趁熱倒入漏斗并分裝于試管，培養基占試管容積1/4～1/5，塞好棉花塞或者硅膠塞，塞2/3入試管內，1/3留在試管外。如果用棉塞要用普通棉花，不要用脫脂棉，因為脫脂棉容易吸水，污染率高。塞好棉塞后的試管每4～5個捆一捆，用報紙或者牛皮紙包好有塞的一頭，豎立于滅菌鍋中在1.1千克/平方厘米（121℃）的壓力下，滅菌30～40分鐘

③擺斜面：滅菌后趁熱將試管取出，擺成斜面，斜面長是試管長的1/2。擺完斜面后要檢查滅菌是否徹底，隨機抽取幾支試管，放入25℃恒溫箱內培養2～3天，如果未發現雜菌，說明滅菌是徹底的。

2.3原種和栽培種的培養基配方和制作

2.3.1谷粒培養基。小麥（大麥）粒培養基：小麥粒87%、米糠5%、稻殼5%、石膏粉2%、生石灰粉1%。優點：省工、速度快；用量小、播種面積大，經濟；體積小節約運輸成本；發菌快。

制作方法：新鮮麥粒篩選干凈—浸泡24～48小時—放入鍋中煮至沒有硬心兒—撈出冷卻—拌入輔料—裝瓶或者袋—滅菌2.5～3小時—出鍋冷卻至20℃以下—接種（每只試管母種可接種原種或栽培種4～6瓶或袋）—移入培養室（24～28℃黑暗條件下）培養15～20天即可長滿瓶或袋。

玉米粒培養基：90%新鮮玉米粒、7%的麥麩、2%的石膏、1%生石灰。

制作方法：新鮮玉米粒浸泡10～12小時，上鍋煮至玉米粒沒有硬心兒，撈出冷卻，拌入輔料，裝瓶或袋入滅菌鍋滅菌。

2.3.2木屑培養。木屑78%，稻殼10%，麩皮10%，石膏1%,生石灰1%，含水量65%；木屑82%，麩皮15%，黃豆粉2%，石膏0.5%，石灰0.5%，含水量65%；木屑77%，稻殼20%，黃豆粉2%，石灰0.5%，石膏0.5%，含水量65%；木屑40%，玉米芯30%，稻殼10%，米糠17%，過磷酸鈣1%，石灰1%，石膏1%，含水量65%。拌料、測水分、調pH值、裝袋、滅菌。

2.3.3糞草培養基：干稻草63%，玉米粉4%，干牛糞25%，大豆粉3%，過磷酸鈣3%，硫酸鎂2%；干稻草80%，麥麩20%，石膏1%。

制作方法：稻草切成3厘米長的段，浸透水后撈起瀝水至不滴，拌入輔料，含水量65%左右。按常規裝瓶、滅菌、培養。

干羊糞88%，碳酸鈣12%。

制作方法：先將干羊糞浸濕，堆積12小時，使水分均勻滲入糞內，然后拌入碳酸鈣即可。

3　消毒和滅菌

消毒和滅菌作為一個獨立的節點單獨提出是因為它往往決定制種的成敗，它貫穿于菌種制作過程的始終，國內一些菌種企業和廠家往往制種失敗，多數原因是制種過程中不能嚴格按照操作規程操作，消毒和滅菌不徹底，從而不能保質、保量按時生產出菌種。

3.1消毒和滅菌的概念

消毒：是指用物理化學方法，殺滅培養料、物體表面及環境中的一部分微生物，只能殺死營養體，不能殺死休眠體和芽孢。

滅菌：是指在一定范圍內用物理化學方法，徹底殺滅培養料內外、容器、用具和空氣中的所有微生物營養體、休眠體和芽孢。

3.2消毒和滅菌的方法

（1）紫外線殺菌：用30～40W紫外線管燈照射20～30分鐘。

（2）甲醛和高錳酸鉀混合熏蒸：一般每立方米需40%甲醛10毫升、高錳酸鉀7～8克，進行熏蒸。

（3）使用消毒劑：用0.1%升汞水浸過的紗布或海綿進行揩擦，或用噴霧器噴霧消毒，噴霧后20～30分鐘，箱內的雜菌和霧滴一起落到箱底被殺死。

4　食用菌菌種分離的方法

4.1概念：子實體組織分離法：是指采用食用菌子實體或菌核、菌索的任何一部分組織培養成純菌絲體的方法。

4.2操作技術要點：①選擇種菇；②種菇消毒；③菇肉接種；④培養；⑤檢查菌種分離情況；⑥提純。

純化培養：待平板中菌絲萌發，長到1.5～2.5厘米時進行菌種純化，將長好的菌絲尖端培養基迅速轉入準備好的試管中進行培養。特別注意：組織分離后得到的母種，必須經過出菇試驗才能在生產中使用。

5　食用菌菌種的保藏方法

5.1保存目的：防止退化，確保菌種純一，防止雜菌感染。

5.2保存原理：主要是通過采用低溫、干燥與缺氧的條件，以中止菌種的繁殖，降低其新陳代謝，使之處于休眠狀態。

5.3菌種保藏的方法：①斜面低溫保存法：將斜面菌種，置于4℃冰箱保存，以后每隔2～3個月轉管移接一次。②液體石蠟保存法：注入一層已滅過菌的液體石蠟，使菌種與空氣隔絕，降低其新陳代謝的活動，然后在棉塞外包以塑料薄膜，一般可保存一年以上。③木屑試管菌種保存法：用雜木屑按原種的培養基配制裝入大號試管，容量為管高的2/3，擦凈管口塞緊棉塞，用牛皮紙包扎管口后高壓滅菌，然后移入母種，在25～28℃下培養，待長滿菌絲后，立即移到低溫干燥環境保存、或埋于尿素、硝酸銨或地洞中保存，效果更好，并能延長保存時間。④冷凍干燥保藏法：這種方法采用真空、干燥、低溫等手段，使菌種新陳代謝活動處于相對靜止狀態，在低溫下快速冷凍，又在低溫下真空干燥，而使菌細胞的結構與成分保持原來狀態而保存菌種。

此外，還有沙土保存法、液氮超低溫保藏法、濾紙片保存法、菌絲球生理鹽水保藏法、麥粒保藏法、干孢子真空保藏法等。

6　食用菌菌種的質量鑒定

6.1母種：①母種概念：是具有結實性的菌絲體純培養物，也稱一級菌種或試管種。②母種鑒定：潔白，健壯，無蟲害，有蘑菇香味。

6.2原種：①原種概念：是由母種轉接到木屑、谷粒等為主的培養基上擴大培養而成的菌絲體純培養物，也稱二級菌種。②原種鑒定：潔白，健壯，有凝水，不干燥。

6.3栽培種：①栽培種概念：是由原種轉接、擴大到相同或相似的培養基上培養而成的菌絲體純培養物，直接應用于生產，也稱三級菌種。②栽培種鑒定：潔白，健壯，有凝水，不干燥，一般不超過35～40天。

7　液體菌種的生產與應用

7.1液體菌種的概念：是指采用液體培養基生產的菌絲體純培養物。菌絲體在培養基中呈絮狀或球狀。

7.2液體菌種的特點：①優點：周期短、產量高。菌齡整齊、菌絲繁殖快；產生的活性物質多：蛋白質、粗多糖、氨基酸；菌體污染少；便于進行機械化接種，在工業化、機械化程度高的部門具有明顯優勢。②缺點：特殊的設備，消毒滅菌要求嚴格；菌絲老化快；不易貯運；掌握不好技術，危險性大。③液體菌種制種設備：搖床、攪拌罐、液體菌種培養罐。④液體菌種發酵工藝：采用逐級擴大的模式，一般為試管斜面菌種→一級搖瓶培養菌種→二級培養小型發酵堆→大型發酵罐。液體菌種制作過程中消毒、滅菌更加重要。

8　如何防止食用菌菌種退化

8.1菌種退化的危害：菌種退化會導致菌絲體生長緩慢；對環境、雜菌等的抵抗力變弱，子實體形成期提前或推后；出菇潮次不明顯等現象。

8.2引起菌種退化的原因：菌種不純和基因突變是主要原因；另外溫度過高、不同菌株的混合栽培等都會引起菌種退化。

8.3防止菌種退化的措施：①保證菌種的純培養，不要用被雜菌污染的菌種；②嚴格控制菌種傳代次數，減少機械損傷，保證菌種活力；③適當低溫保存菌種；④避免在單一培養基中多次傳代；⑤菌種不宜過長時間使用；⑥菌種要定期進行復壯；⑦每年進行孢子分離，以有性繁殖來發現優良菌株，以組織分離來鞏固優良菌株，保持遺傳特性。