單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌液相芯片檢測方法的建立

黨亞麗 周亭屹

摘 要：目的是建立一種快速檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的液相芯片檢測方法。采用基于間接競爭法的原理，將3種細菌抗原分別與不同的聚苯乙烯微球偶聯，以藻紅蛋白（PE）熒光標記二抗為信號，優化反應條件，對建立的方法進行靈敏度、特異性和可重復性驗證。結果顯示，3種細菌檢測抗體最佳加入量分別為10ng、10ng、5ng，建立的方法檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的最低檢測限均可達到103 CFU/mL，檢測其他常見食源性致病菌無交叉反應。結論表明，建立了一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的液相芯片檢測方法，能夠應用于實際樣品的檢測。

關鍵詞：單增李斯特菌 副溶血弧菌 沙門氏菌 液相芯片 檢測

前言

近年來，食源性疾病已成為世界上最突出、最廣泛的食品安全問題，病原微生物引起的食源性疾病則是影響食品安全的最主要因素之一[ 1 ]。微生物性食物中毒事件主要由食物污染或變質、生熟交叉污染等原因引起，且氣溫較高、氣候潮濕的環境適于細菌生長繁殖，導致食物易于腐敗變質，一旦儲存、加工不當，極易發生由沙門氏菌、副溶血性弧菌等微生物引起的食物中毒。現行檢測手段已無法滿足日常對食源性致病菌檢測的需要，目前檢驗檢疫工作中常用于檢測和鑒定食源性致病菌的方法主要有PCR、Southem Blot雜交、酶聯免疫吸附法（ELISA）等一些簡單的分子生物學和免疫學方法[ 2 ]。現行的檢測方法一般以檢測致病菌為主，需要增菌培養，檢測時間長，無法滿足高通量的檢測要求，遠不能滿足食品檢測的需要，市場迫切需要能同時檢測食源性致病菌的靈敏度更高、特異性更強、簡便快捷的高通量技術和方法[ 3 ]。因此，目前迫切需要發展一種快速、準確的方法來檢測和追蹤病原體和污染物的來源[4]。

液相芯片技術是在流式細胞技術、酶聯免疫吸附技術和傳統芯片技術基礎上開發的新一代生物芯片技術和新型蛋白質研究平臺，能同時檢測多種致病菌。邱楊等[ 5 ]通過該法建立了對沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片檢測方法，檢測靈敏度達到50～100copies/mL。郭啟新等[ 6 ]建立了對金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的檢測方法，具有很好的特異性，檢測靈敏度分別達38、44、21CFU/mL。Sun等[ 7 ]利用該法建立了高通量的同時檢測6種食源性致病菌的方法，檢測靈敏度達到20.4×103CFU/mL，遠高于PCR。

但基于多重PCR的液相芯片技術對單管樣本進行大量不同指標的高通量多重PCR方法建立仍存在困難，至今鮮見液相芯片用于檢測多種致病菌方法建立的相關報道。將液相芯片技術應用到食源性致病菌檢測中，可在短時間內實現對多個樣品同時進行多種致病菌靈敏、準確的檢測，因而有望大大提高食源性致病菌的檢測效率，在有效控制食物中毒事件的發生、食品安全控制、海關進出口檢驗檢疫、臨床診斷等方面具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

Luminex 200液相懸浮芯片系統（美國Luminex公司）；4625型孔板振蕩器；ST16R冷凍離心機（美國Thermo公司）；編號No.18、No.29、No.52的微球（美國Luminex公司）。活化緩沖液：0.1mol/L NaH2P04- N a2 HP04，pH6.2；磷酸鹽緩沖液（PBS）：138mmol/L NaCI，2.7mmol/L KCl，8mmol/ L Na2HP04，1.5mmol/L KH2P04，pH7.4；洗滌緩沖液：PBS，0.05%Tween-20，pH7.4；分析緩沖液：PBS，1%BSA，pH7.4；封閉緩沖液：50mmol/L Tris，153mmol/L NaCl，2%BSA，0.05%Tween-20，pH7.4；儲存緩沖液：PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%疊氮化鈉，pH7.4。菌種為本實驗室保藏與西北農林科技大學食品實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 微球偶聯抗原

①取微球50μL（1.25×106個/mL）置于EP管，14000g離心4min，棄上清液。

②加入40μL活化緩沖液重懸微球，漩渦混合30s。

③加入50mg/mL NHS和EDC各5μL，混勻，避光室溫下旋轉混合600rpm，20min。

④加入150μL PBS，漩渦混合10s，14000g離心4min，棄上清液。

⑤用PBS洗滌3次后，加入150μL PBS重懸，再加入抗原，用PBS補齊至500μL，避光室溫旋轉混合600rpm，2h。

⑥14000g離心4min，棄上清液。

⑦加入150μL封閉緩沖液，漩渦混合15s，避光室溫旋轉混合600rpm，30min。

⑧16000g離心4min，棄上清液，加入100μL儲存緩沖液4℃保存偶聯的微球。抗原加入量為50ng。1.2.2 檢測

①取出偶聯微球，恢復至室溫后漩渦30s。

②96孔板中加入100μL PBS預濕實驗孔，抽去孔內液體，每孔中加入適量預混好的偶聯微球（約2000個），用150μL PBS洗滌兩次。

③將適量標準品或樣品分別加入合適的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入適量的抗體，用PBS補齊各孔至100μL。

④用移液器反復抽吸混勻孔內溶液，避光條件下37℃，600rpm振蕩60min。

⑤反應完畢后，抽去孔內液體，用150μL PBS洗滌兩次。

⑥每孔中加入100μL經適當稀釋的PE標記二抗，移液器反復抽吸混勻。

⑦避光條件下，37℃，600rpm振蕩45min后，抽去孔內液體，用150μL PBS洗滌兩次。

⑧加入100μL PBS，900rpm震蕩3min重懸浮微球并混勻，置于液相芯片系統進行測試，每種微球讀取100個。

1.3 實驗條件優化以及標準曲線的建立

1.3.1 最佳抗體加入量的確定

在不加樣品和標準品的情況下，分別加入對應抗體1、5、10、20和40ng，加入過量的PE標記二抗，采用液相芯片系統測試。

1.3.2 單一標準曲線建立

3種標準品按照一定的比例稀釋成梯度液，采用液相芯片系統測試。按照ELISA所采用的抑制率計算方式（抑制率B=（A0-An）/A0，其中A0為不加樣品孔MFI值；An為加標準品或者樣品孔MFI值），將各孔MFI值換算成抑制率，以抑制率為縱坐標，濃度的對數值為橫坐標，建立單一標準曲線。

1.3.3 靈敏度

用PBS緩沖液將培養的菌10倍系列稀釋，取1 08～102CFU/mL用已建立的方法進行檢測。每個濃度重復檢測3次，驗證該方法的靈敏度。

1.3.4 特異性

用已建立的方法檢測7種常見的食源性致病菌，每個樣品重復檢測3次，驗證該方法的特異性。

1.3.5 重復性

在1d、5d、7d用此方法分別檢測陽性菌和陰性菌，驗證該方法的重復性。

2 結果與討論

2.1 抗體加入量優化

如圖1所示，低濃度時，隨著抗體加入量的增加，MFI值迅速升高。抗體量增大至一定值后，種抗體的MFI值均趨于平穩，此時抗原的位點已被全部占據。選擇MFI的拐點為最佳抗體加入量，因為此時靶標物和探針競爭結合獸藥抗體的競爭結果變化最顯著。單增李斯特菌、副溶血弧菌、沙門氏菌抗體加入量分別為10ng、10ng、5ng。

2.2 一元標準曲線建立

在加入最優抗體量的條件下，建立了一元標準曲線。在一定濃度范圍內，抑制率與抗原濃度呈現良好的線性關系。單增李斯特菌方程為y=0.1935ln（x）-0.2924，R2=0.9869，副溶血弧菌方程為y=0.1748ln（x）+0.2054，R2=0.9909，沙門氏菌方程為y=0.2469ln（x）-0.1658，R2=0.9887。

2.3 靈敏度檢測

由圖3可看出，三種細菌在濃度達到103CFU/mL時仍可被檢出。因此本方法的靈敏度較高，可達到103CFU/mL。

2.4 特異性的檢測

用已建立的方法進行檢測，從圖4中可看出此方法特異性良好，與其它菌無交叉反應。

2.5 重復性試驗

在1d、5d、7d用此方法分別檢測陽性菌和陰性菌，由圖5可見陽性菌，陰性菌MFI值上下浮動都不大，可證明本方法重復性較好。

3 結論

2001年，美國FDA批準液相芯片技術可應用于臨床診斷，這是唯一由美國FDA批準用于臨床診斷的生物芯片技術。目前，液相芯片技術已應用于病原菌的檢測、腫瘤標志物的檢測、細胞因子檢測、自身免疫性疾病診斷等方面。

國家標準方法檢測食品中的病原微生物，需先對可疑樣品增菌1～2d，然后接種于平板進行分離培養，之后再進行生化試驗等進行鑒定，所需材料和試劑繁多，而且分型鑒定等需有經驗的人員來完成；使用PCR檢測病原體也存在一定缺陷，特別是在大量樣本的檢測中，單一PCR費時費力，而多重PCR體系尚不成熟，擴增背景高，靈敏度和特異性較低。

本實驗建立了一種應用液相芯片技術檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的方法。由于整個反應過程完全在液相環境中進行，故靈敏度較高，可達到103CFU/mL；該方法特異性好，檢測選擇的幾種常見食源性致病菌，特異性可達100%。與傳統方法相比，本方法耗時短，4h即可完成檢測；需要樣品量少，只需10 μL的菌液。

綜上所述，本實驗建立了一種快速檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的液相芯片技術，其為一種優于傳統檢測方法的快速、準確、高通量的新型檢測技術，在食品檢驗檢疫方面具有廣闊的開發前景。該方法的建立也為其他致病菌快速、高通量檢測提供了參考。

參考文獻：

[1] Tayel A A， Tras W F E. Anticandidal activity of pomegranate peel extract aerosol as an applicable sanitizing method[J]. Mycoses， 2010， 53（2）：117-122.

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[3] Schrenzel J. Clinical relevance of new diagnostic methods for bloodstream infections. Int. J. Anti.Agen， 2007， 30（Suppl.）， 2-6.

[4] CDC health protection research guide 2006-2015 （2005）.

[5] 邱楊，肖性龍，吳暉等.五種致病菌流式液相芯片檢測方法的建立[J].現代食品科技，2010，26（8）：889-893.

[6] 郭啟新，張蕾，張柏棋，等.液相基因芯片法同時檢測3種食源性病原菌[J].食品科學，2013，34（16）：191-195.

[7] Sun Z， Peng Y， Zhang M， et al. Simultaneous and highly sensitive detection of six different foodborne pathogens by high-throughput suspension array technology [J]. Food Contr.，2014，40（2）：300-309.

浙江省醫藥衛生項目（項目號：2014C02023）。