利用高通量測序法分析中國北方葡萄園土壤細菌的多樣性

宋雪潔， 劉　波， 劉天明

(齊魯工業大學/山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南 250353)

葡萄園的地理位置、土壤類型及肥力狀況對葡萄、葡萄酒的質量都有一定影響，尤其是土壤中的某些元素影響著葡萄植株的生長及果實產量和質量[1]。葡萄樹和土壤微生物群落之間有著密切的互生關系，土壤微生物的種群多樣性和功能多樣性對維持土壤生態系統動態平衡、促進根系營養吸收利用起到主要作用，同時葡萄樹通過影響土壤環境來影響土壤微生物的結構和多樣性[2]。葡萄作為多年生藤本植物，不可能年年輪作清茬，且施肥與灌溉方式受限，這會明顯影響土壤微生物的多樣性[3]。因此，研究葡萄園土壤微生物多樣性，對合理制定土壤管理措施、促進根際微生物結構優化、實現葡萄的優質豐產有現實的指導意義[4]。另外，葡萄果實品質的形成與生態因子、配套農業技術密切相關，目前，有關溫度、降水等生態因素及灌溉方式、整形架式、施肥措施等農業耕作制度對葡萄生長發育和品質的影響已有大量報道[5-7]，而不同生態地域葡萄園土壤微生物的多樣性研究相對較少，葡萄根際微生物菌群數量、結構變化與土壤肥力、地上葡萄果實品質、釀酒品質的相關性研究相對更少。探討不同地域、不同深度的根際微生物群落差異性，對合理指導和完善施肥制度、合理改良土壤肥力、釀造優質的葡萄酒同樣有現實的指導意義。

基于形態學、生理學、分子生物學等傳統方法研究微生物群落的多樣性已取得較多的科研成果，但由于土壤中絕大部分微生物是不可培養的，傳統的分離鑒定方法只能區分環境微生物種類中的0.1%～10%，而變性梯度凝膠電泳(DGGE)也僅能夠反映有限的優勢微生物類群，這導致對環境微生物群落多樣性的認識受到限制[8]，有可能會低估土壤微生物的物種組成，并高估其豐度。李橋利用高通量技術研究細菌群落對鹽生植被演替的響應發現，盡管取樣地點不同，但處于相同生境中的微生物類群有相似性，不同植被類型的土壤主要微生物群落結構存在明顯不同[9]。本研究采用以宏基因高通量測序技術為導向的細菌鑒定和檢測方法，能快速、全面、準確地探究葡萄根際微生物的群落種類、數量，可獲取更加豐富的微生物多樣性信息，對傳統培養法難于觀察到的微生物種類及功能研究提供了可行性。

1　材料與方法

1.1　樣品采集

2015年8月，從甘肅省蘭州市和武威市威龍基地、寧夏回族自治區銀川市永寧縣、河北省懷來縣、山東省德州市和東營市用孔徑為4 cm的滅菌打孔器采集16年生葡萄樹根際土壤，各采樣點的取樣深度及園區概況見表1。葡萄越冬方式均為下架埋土，施肥耕作深度為20～40 cm，采用渠灌方式補水；每個土樣由同一果園8個采集點的土壤進行混合，取適量裝入土袋中，迅速帶回實驗室[10]；無菌條件下將土壤樣品粉碎，過孔徑為0.284 cm的篩網；四分法留取土樣，4 ℃條件保存備用[11]。

表1　土樣采集園葡萄栽培和管理基本概況

1.2　土壤微生物總DNA的提取

采用Omega soil DNA kit試劑盒提取13個土壤樣品中的微生物基因組DNA。

1.3　細菌16S rDNA PCR擴增及測序

13個樣本分別用不同的序列標簽條碼進行區分，引物添加長度為8 bp。采用特異性引物為F515：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′、R907：5′-CCGTCAATTCMTTTR AGTTT-3′[12]對細菌16S rRNA基因V4區進行擴增。PCR反應體系為Q5 DNA聚合酶0.25 μL，5×擴增緩沖液5 μL，5×GC緩沖液5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，模板DNA 1 μL，10 μmol/L正向、反向引物各1 μL，水11.25 μL。PCR擴增條件為：98 ℃預變性30 s；98 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環25～27次；72 ℃延伸5 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，20 min)檢測，用美國產Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段，樣品送上海派森諾生物科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4　序列獲取與分析

1.4.1優質序列的獲取高通量測序建庫過程中PCR擴增會產生嵌合體序列，測序過程中會產生點突變等測序錯誤，故運用Qiime 1.9.0軟件進行序列過濾[13]，運用mothur 1.31.2軟件中uchime方法去除嵌合體序列[14-15]，以保證分析結果的準確性，得到可用于后續分析的優質序列。

1.4.2基于操作分類單元(OTU)的分析對河北省懷來縣5個不同土層深度的土樣基于操作分類單元(OTU)進行分析，使同一單元序列的相似度≥97%。

1.4.3稀釋性曲線的制作對河北省懷來縣5個不同土層深度、相似度≥97%的土樣細菌序列，以隨機抽取的短序列(reads)數目為橫坐標，以該數目下聚類后得到的OTU數目為縱坐標制作稀釋性曲線，如果reads數據增加過程中曲線趨于平行，則表明隨reads數目的增加，OTU數目不會有較多的增加，此時已達到足夠的測序數據量[16]。

1.4.4群落結構分析基于“門”分類單元，對河北省懷來縣5個土層土樣的微生物群落結構進行分析，基于“屬”分析其分布和豐度情況；對甘肅蘭州市等7個地區施肥、未施肥土壤的微生物物種數量進行統計。

2　結果與分析

2.1　優質序列的獲取

由表2可知，河北省懷來縣5個不同土層深度土樣的優質序列占有效序列[15]的比例在86.98%以上，涵蓋大部分土壤微生物的基因序列。由圖1可見，土樣的優質序列長度為225 bp左右。

表2　不同土層深度土樣的序列數據統計

2.2　基于操作分類單元(OTU)的分析

由表3可知，隨土層采樣深度的增加，10～70 cm土層微生物種類由多到少依次遞減，0～10 cm近地表土層的微生物種類明顯少于土層10～40 cm的微生物種類，與深度40～50 cm 土層的微生物種類相近，10～30 cm土層的微生物種類相對最多。由圖2可見，在23 382個基于“門”分類單元中，有1 384個是5個不同深度土層共有的，占5.9%，土樣Hd1、Hd2、Hd3、Hd4、Hd5中各自特有的分類單元分別有41、502、215、74、4個，這表明不同深度土壤分布的微生物，絕大多數種類在各層間有差異，不論從哪個分類水平看，特有種類分類單元主要分布在10～40 cm土層，60 cm下土層的微生物種類數量急劇減少。

表3　不同土層深度土樣相似度≥97%的分類單元統計

2.3　稀釋性曲線

高通量測序所得序列數量的多少直接決定著不同相似性水平上所能分辨出的系統發育分類物種數量的多少[17]。由圖3可見，隨測得序列數量的增加，曲線雖趨于平緩，但有微小的上升趨勢，說明Illumina Miseq測序獲得了樣品中絕大部分細菌序列，但仍處于不飽和狀態。分析表明，在97%相似性水平上，5個不同深度土樣的細菌序列覆蓋度在86.98%～93.81%之間，更直觀說明本研究已獲取絕大多數的樣本信息，基本能夠比較真實地反映研究區的細菌群落組成情況。

2.4　群落結構分析

由圖4、圖5可見，5個土樣中，占優勢的物種有9個門，從多到少依次為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠屈撓菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，占比分別為34.9%、20.1%、13.6%、8.6%、6.5%、3.7%、2.8%、2.7%、2.5%；芽單胞菌門、綠屈撓菌門在0～10 cm的土層中豐度較高，芽單胞菌門從表層土到深層土豐度逐漸減少；放線菌門、擬桿菌門、綠屈撓菌門在10～30 cm土層中豐度較高，放線菌門中的類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)占菌種的2.1%，擬桿菌門中的噬纖維細菌科占菌種的2.4%；放線菌門、浮霉菌門、疣微菌門在30～40 cm的土層中豐度較高，而硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門的豐度向上、下2層逐漸遞減；厚壁菌門在40～50 cm土層中豐度較高；60～70 cm土層的微生物群落中，放線菌門、綠屈撓菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、疣微菌門比其他土層中的豐度有明顯降低，酸桿菌門、變形菌門則明顯升高，酸桿菌門中的iii1-15菌科成為優勢菌種，占 24.6%，變形菌門中的華桿菌科占12.6%、紅螺菌科占5.2%。

由表4可見，在施農家肥條件下，河北省釀酒葡萄赤霞珠2個土樣Hs1、Hs2在“屬”分類水平上物種數量具有相似性，而與同樣來自河北省種植鮮食葡萄馬奶子的土樣Hn在“屬”分類水平上差異相對較小，表明施用同樣農家肥條件下，品種對微生物物種的數量影響相對較小；甘肅土樣Gh、寧夏土樣Nb、山東土樣Sy這3個土樣的物種數量差異相對較大，表明地域對物種的數量影響相對稍大；未施農家肥的甘肅土樣Gl、山東土樣Sd、河北土樣Hd1與施農家肥的土樣在“屬”分類水平上物種數量有明顯差異；比較甘肅土樣Gh、Gl與河北土樣Hn、Hd1的物種數量發現，農家肥的影響比地域影響更為明顯；無論鮮食葡萄還是釀酒葡萄，在施農家肥條件下土壤中的微生物在屬分類水平上具有相似的群落組成，可聚類到一起(圖5)。

3　結論與討論

從土層10 cm開始，隨著土層的加深，葡萄園土壤中細菌種類呈下降趨勢，與李艷麗等在梨上的研究結論[18]一致；0～10 cm土層的細菌種類明顯較少，與40～50 cm土層的細菌種類相當；10～30 cm的耕作層即葡萄根系分布區寄居的細菌種類數相對最多，這與欒麗英等的研究結論[19]相似；地表和50 cm以下非耕作層細菌數相對減少，這與根際分布規律和地上、地下深層生態微環境相對應，可能是地表冬夏溫濕度變化劇烈，紫外線強烈，外界環境對細菌的影響較大，導致表層土的細菌種類相對較少，加之通氣良好，生存著好氧菌和抗逆境的細菌類型或光合菌類，而50 cm以下土層土壤養分貧瘠、缺氧，可能主要分布著厭氧菌和化能自養菌。10～30 cm土層冬夏溫濕度相對穩定，根際有機物分泌豐富、肥水豐沛，水、肥、氣、熱等因子有利于多種細菌的繁衍，聚集著大量好氧、厭氧及兼性厭氧菌。

表4　不同地區土樣物種數量統計

袁瑩瑩等研究認為，生物有機肥施用可提高土壤中細菌和放線菌的數量，且有益菌群對土壤微生物有一定的活化作用[20]。胡可等利用Biolog法研究不同施肥處理下土壤微生物功能多樣性表明，生物有機肥處理更能提高土壤中微生物的活性[21]。蔡燕飛等研究表明，施用生態有機肥可以提高土壤微生物多樣性和土壤質量，能調控土壤微生物群落結構，促進土壤有益微生物生長，在保持微生物多樣性與生態穩定性方面起著重要的作用[22]。羅希茜等研究表明，有機肥有利于提高微生物群落物種數量、優勢種的優勢度及各物種的豐度[23]，這可能是由于有機肥的C/N有利于土壤微生物的生長。本研究中，施用農家肥改變了葡萄園土壤微生物的群落組成，提高了細菌的生物多樣性。

高通量測序能夠較為全面和準確地反映土壤微生物群落結構，而變性梯度凝膠電泳(DGGE)僅能反映有限的優勢微生物類群，在很大程度上極可能低估土壤微生物的物種組成并高估其豐度[24]。在不同的微生物分類水平上，通過高通量測序可檢測到葡萄園土壤36門102綱141目181科212屬，而這是DGGE技術遠遠不能達到的[25]。

參考文獻：

[1]張云峰，李艷，嚴斌，等. 葡萄園土壤中4種金屬元素的測定及其對葡萄和葡萄酒的影響[J]. 食品科學，2010，31(24)：374-379.

[2]楊海君，肖啟明，劉安元. 土壤微生物多樣性及其作用研究進展[J]. 南華大學學報(自然科學版)，2005，19(4)：21-26，31.

[3]劉靈芝，呂德國，秦嗣軍. 果園土壤生態系統功能微生物多樣性研究進展[J]. 北方果樹，2014(6)：1-4.

[4]王保莉，岑劍，武傳東，等. 過量施肥下氮素形態對旱地土壤細菌多樣性的影響[J]. 農業環境科學學報，2011，30(7)：1351-1356.

[5]王銳，孫權，郭潔，等. 不同灌溉及施肥方式對釀酒葡萄生長發育及產量品質的影響[J]. 干旱地區農業研究，2012，35(5)：123-127.

[6]周軍，蘭彥萍，齊建勛，等. 灌溉方式對葡萄果實品質及礦質營養元素的影響[J]. 寧夏農林科技，2001(3)：8.

[7]毛娟，陳佰鴻，曹建東，等. 不同滴灌方式對荒漠區‘赤霞珠’葡萄根系分布的影響[J]. 應用生態學報，2013，24(11)：3084-3090.

[8]Pace N R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere[J]. Science，1997，276(5313)：734-740.

[9]李橋. 基于高通量測序技術下土壤微生物群落結構的研究[D]. 濟南：山東師范大學，2014：53-54.

[10]劉瑋琦. 保護地土壤細菌和古菌群落多樣性分析[D]. 北京：中國農業科學院，2008：22-22.

[11]馬艷. 基于PCR-RFLP技術的當歸根際土壤細菌研究[D]. 蘭州：西北師范大學，2014：14-15.

[12]Xia W，Zhang C，Zeng X，et al. Autotrophic growth of nitrifying community in an agricultural soil[J]. The ISME Journal，2011，5(7)：1226-1236.

[13]Caporaso J G，Kuczynski J，Stombaugh J，et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods，2010，7(5)：335-336.

[14]Schloss P D，Westcott S L，Ryabin T，et al. Introducing mothur：open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology，2009，75(23)：7537-7541.

[15]Edgar R C，Haas B J，Clemente J C，et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics，2011，27(16)：2194-2200.

[16]張俊. 根結線蟲土壤微生物多樣性研究[D]. 昆明：云南大學，2015：13-87.

[17]敏玉霞. 青藏高原凍土區甜水海湖盆沉積物微生物多樣性及其與環境關系的研究[D]. 蘭州：蘭州大學，2013：16-18.

[18]李艷麗，趙化兵，謝凱，等. 不同土壤管理方式對梨園土壤微生物及養分含量的影響[J]. 土壤，2012，44(5)：788-793.

[19]欒麗英，房玉林，宋士任，等. 不同樹齡釀酒葡萄不同土壤深度根際和根區微生物數量的研究[J]. 西北林學院學報，2009，24(2)：37-41.

[20]袁英英，李敏清，胡偉，等. 生物有機肥對番茄青枯病的防效及對土壤微生物的影響[J]. 農業環境科學學報，2011，30(7)：1346-1350.

[21]胡可，王利賓. BIOLOG微平板技術在土壤微生態研究中的應用[J]. 土壤通報，2007，38(4)：819-821.

[22]蔡燕飛，廖宗文，章家恩，等. 生態有機肥對番茄青枯病及土壤微生物多樣性的影響[J]. 應用生態學報，2003，14(3)：349-353.

[23]羅希茜，郝曉暉，陳濤，等. 長期不同施肥對稻田土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態學報，2009，29(2)：740-748.

[24]夏圍圍，賈仲君. 高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價[J]. 微生物學報，2014，54(12)：1489-1499.

[25]Stahl D A，Lane D J，Olsen G J，et al. Analysis of hydrothermal vent-associated symbionts by ribosomal RNA sequences[J]. Science，1984，224(4647)：409-411.