大豆食心蟲高毒力球孢白僵菌菌株的篩選

陶淑霞， 陸子慧

(吉林農業大學農學院，吉林長春 130118)

大豆食心蟲(Leguminivoraglycinivorella)為單食性害蟲，主要危害大豆，分布于我國東北、華北及山東等地，以東北三省危害嚴重，主要為幼蟲蛀莢危害，常年蛀食率為10%～20%，嚴重時蛀食率為30%～40%，嚴重影響大豆的產量和品質[1]。初孵幼蟲在豆莢上爬行數小時后，鉆入豆莢進行危害，發育至老熟幼蟲后脫莢，鉆入土中越冬，大豆食心蟲的整個世代只有很短時間是暴露在外的，因此防治非常困難。目前，主要是在成蟲發生盛期以菊酯類藥劑防治大豆食心蟲[2-3]。

球孢白僵菌(Beauveiabassiana)是害蟲微生物防治中一種重要的蟲生真菌，可侵染15個目的昆蟲和一些螨類，具有分布范圍廣、侵染力強、易于形成真菌流行病等特點，因此被認為是具有開發潛力的生防真菌[4-5]。球孢白僵菌不同菌株對目標害蟲的毒力存在著顯著差異[6-8]。

球孢白僵菌是大豆食心蟲幼蟲的寄生性病原真菌，自然寄生率為5%～10%，是造成大豆食心蟲自然死亡的主要因素之一[9]。為提高球孢白僵菌對大豆食心蟲老熟幼蟲的防治效果，須要篩選對此蟲具有高毒力的菌株。本研究采集自然球孢白僵菌菌株，并對其生物學性狀、毒力等指標進行比較研究，旨在篩選出生物學性狀優良，且對大豆食心蟲老熟幼蟲具有高毒力的菌株，以期為大豆食心蟲的生防技術提供指導。

1　材料與方法

1.1　供試菌株及培養基

供試菌株分別采自吉林省長春市、黑龍江省哈爾濱市和牡丹江地區的大豆食心蟲越冬幼蟲，采集后進行分離與純化。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，簡稱PDA；配方為200 g馬鈴薯，30 g葡萄糖，20 g瓊脂，10 g酵母，1 000 mL 蒸餾水)。薩氏培養基(sabouraud dextrose agar with yeast extract，簡稱SDAY；配方為40 g葡萄糖，20 g瓊脂，10 g酵母，10 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水)。薩氏液體培養基(sabouraud dextrose with yeast extract，簡稱SDY；配方為40 g葡萄糖，10 g酵母，10 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水)。供試菌株的寄主昆蟲及采集地點如表1所示。

1.2　供試昆蟲

在吉林農業大學大豆中心收集自然脫莢的大豆食心蟲老熟幼蟲，選取發育整齊一致的幼蟲作為供試昆蟲。

1.3　菌落生長性狀觀察

分別取各分離菌株平板上的孢子粉，配制濃度為1.0×107個/mL的孢子懸浮液。取5 μL孢子懸浮液接在含有PDA培養基的培養皿中，重復3次，于25 ℃條件下培養，觀察并記錄各菌株菌落的形態，在第14天時測量各菌株菌落的直徑。

表1　供試菌株的寄主昆蟲和采集地點

1.4　產孢量測定

在各菌株培養至第14天時，用打孔器(直徑為10 mm)在菌落半徑1/2處打孔取菌塊，每個菌株重復3次，將菌塊置于三角瓶中，加入20 mL 0.05%吐溫-80溶液，充分攪拌得到孢子懸浮液，利用血球計數板對孢子懸浮液進行觀察計數。

1.5　孢子萌發率測定

分別取各菌株平板培養的分生孢子適量，加入20 mL SDY培養基中，配制濃度為1.0×106個/mL的孢子懸浮液，在25 ℃，130 r/min條件下培養24 h后，吸取20 μL菌液滴在血球計數板上，置于顯微鏡下，觀察并記錄孢子的萌發情況，芽管長度大于或等于孢子直徑的孢子視為萌發[10]。

1.6　胞外蛋白酶含量測定

平板由質量體積比為1.0%的明膠和質量體積比為 1.5% 的瓊脂配成。各菌株分別配制成濃度為1×108個/mL孢子懸浮液，各取10 μL滴于平板中心，每個菌株重復3次，于25 ℃條件下培養4 d后，將15%的HgCl2溶液倒入平板。在垂直2個方向分別測量透明環直徑和菌落直徑，以兩者比值作為胞外蛋白酶產酶量的指示值。

1.7　毒力測定

1.7.1菌土的制備選取生物學性狀良好的3個菌株(Cc-2、Cc-3、Mdj-3)用于毒力測定。將3個菌株的孢子懸浮液均勻涂在SDAY培養皿中，于25 ℃條件下培養10 d，取 0.5 mg 孢子粉，加入50 mL 0.05%吐溫-80溶液中，配制成孢子懸浮液，在顯微鏡下測定該孢子懸浮液的濃度，計算出1 g孢子粉所含的孢子數。稱取孢子粉與滅菌土(過50目篩)充分混勻，配制成含孢子數為1.0×107個/g的菌土，備用。

1.7.2測定方法取滅過菌的土壤并將其配制成含水量為20%的土壤，盛于塑料杯(8 cm×12 cm)中，然后在表面均勻灑上配制的菌土(以未施用菌土為CK)，每杯接入20頭供試昆蟲，待幼蟲入土后，置于溫度為25 ℃條件下培養，每個菌株設3個重復，在接種后第4、6、8、10天進行調查，計算不同時間的死亡率、校正死亡率、侵染率和致死中時(median lethal time，簡稱LT50)。

1.8　數據分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗各菌株生物學性狀及其對大豆食心蟲毒力的差異顯著性(P<0.05)，用回歸分析的Probit分析供試菌株對大豆食心蟲的致死中時(LT50)。

2　結果與分析

2.1　不同菌株菌落形態分析

在PDA培養基上不同菌株的菌落形態存在較大的差異。由表2可知，菌株Cc-2、Cc-3、Mdj-1、Mdj-3和Heb-1均屬薄粉狀菌落，孢子層厚且產孢早；菌株Cc-1屬絨毛狀菌落，即菌絲生長速度快，但產孢量少；菌株Mdj-2、Heb-2均屬氈狀菌落，產孢量介于薄粉狀和絨毛狀之間。

表2　各菌株在培養基上的形態特征

2.2　不同菌株生長速率、產孢量、孢子萌發率的比較分析

由表3可知，不同菌株的生長速度存在顯著差異(F7，23=218.09，P<0.000 1)。菌株Cc-1營養生長最快，第14天時菌落直徑達61.66 mm，其次是菌株Cc-3、Mdj-3、Cc-2，菌落直徑分別為59.36、54.18、52.14 mm，菌株Heb-2營養生長最慢，第14天時菌落直徑為28.36 mm。各菌株的產孢量差異顯著(F7，23=40.77，P<0.000 1)。菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的產孢量較大，分別為1.26×108、1.14×108、1.32×108個/mL，菌株Cc-1的產孢量最低，為0.27×108個/mL。各菌株的萌發率也存在顯著差異(F7，23=11.03，P<0.000 1)，菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的萌發率較高，分別為96.01%、93.74%、95.17%。

表3　各菌株菌落直徑、產孢量及萌發率

注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下表同。

2.3　不同菌株的胞外蛋白酶活性比較分析

由圖1可知，培養96 h后各菌株胞外蛋白酶產生水平有顯著差異(F7，23=15.13，P<0.000 1)。菌株Cc-2和 Mdj-3 產酶量較高，產酶水平分別為2.03、1.88，兩者差異不顯著；其次是菌株Cc-3，產酶水平為1.57，其他菌株的胞外蛋白酶產酶量較低。

2.4　不同菌株對大豆食心蟲的毒力分析

在上述研究的基礎上，決定選取生物學性狀優良的菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3進行致病力測定。由表4可知，不同菌株之間對大豆食心蟲的校正死亡率(F2，8=22.05，P=0.002)和侵染率(F2，8=38.71，P<0.000 1)有顯著差異，其中菌株Cc-2對大豆食心蟲毒力最強，施藥后第10天校正死亡率高達92.55%，侵染率為90.00%，致死中時LT50為 6.54 d。

表4　不同菌株對大豆食心蟲老熟幼蟲的毒力分析

3　討論

不同來源的球孢白僵菌具有明顯的寄主專化性[11]。姚劍等通過測定球孢白僵菌對馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)和淡色庫蚊(Culexpipienspallens)的毒力，確定不能用球孢白僵菌對淡色庫蚊的毒力測定來代替對馬尾松毛蟲的毒力測定，驗證了其寄主專化性的存在[12]?？梢?，應用白僵菌防治害蟲最重要的是篩選對靶標害蟲致病力強的菌株。

劉玉軍等篩選了對櫟旋木柄天牛(Aphrodisiumsauteri)高致病力Bb202菌株，該菌株產孢能力強且孢子萌發速度快[6]。張海劍等通過測定不同球孢白僵菌菌株對二點委夜蛾(Athetislepigone)的毒力，篩選出毒力較強的Ed-41菌株，該菌株具有生長快、孢子萌發速率高、產孢量大等優良性狀[7]。結果表明，對大豆食心蟲高致病力的菌株具有良好的生物學性狀，可見，球孢白僵菌的生物學指標與菌株的致病力具有明顯的相關性。

蟲生真菌的蛋白降解酶能夠分解寄主昆蟲體壁中的蛋白質，有利于真菌穿透寄主體壁形成侵染[13-14]。馮明光發現，不同球孢白僵菌菌株胞外蛋白酶的產生量與供試昆蟲的死亡率呈顯著正相關關系[15]。結果表明，對大豆食心蟲致病力強的菌株，其胞外蛋白酶的產生水平也較高。本研究中篩選的Cc-2菌株具有營養生長快、孢子萌發率高、產孢能力強且對大豆食心蟲具有高毒力的特點，可作為防治大豆食心蟲的生防菌株。

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