利用農業廢棄物對青霉菌進行固態發酵生產纖維素酶

訾　慧， 白洪志， 王　惠， 韓曉日， 劉　寧， 黃玉茜， 韓　梅， 楊勁峰

(1.沈陽農業大學土地與環境學院，遼寧沈陽 110866； 2.沈陽農業大學生物科技學院，遼寧沈陽 110866)

木質纖維素是所有植物的基石，并普遍存在于地球的大部分地區，木質纖維素的化學組成使其成為巨大的生物技術價值的基材。纖維素、半纖維素和木質素的基本化學結構對木質纖維素的構架能產生深遠的影響[1]。利用生物質過剩、農業廢棄物和農產品加工業廢渣生產新能源的概念，生物發酵得到了越來越多的關注。因為隨著石化燃料由短缺變枯竭，能源是人類面臨的共同問題。尋找新的能量來源關系到經濟的可持續發展乃至人類的生存[2]。

固態發酵作為纖維素生物轉化的手段，在過去的幾十年中，利用固態發酵技術生產大量化學品和酶有逐漸增加的趨勢[3]。固態發酵和液態發酵之間的直接比較是非常困難的，主要由于這2種技術使用了不同的微生物濃度，但固態發酵中的微生物具有更高的代謝能力，因為它們在接近自然的環境下增殖。這種方法能通過比液態發酵能源需求少、發酵罐體積小、污染物排放少等特點來產生更穩定的產品[4]。

微生物所產生的纖維素酶系是一個多組分酶系，通常將纖維素分為內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[5]。在工業生產過程中所用的纖維素酶是主要由真菌分泌的胞外酶。所述酶可以有效地降解木質纖維素底物的纖維素鏈，以產生更小的糖單元如纖維二糖和葡萄糖[6]。纖維素酶在食品、釀造行業、農副產品、深加工飼料、醫藥、環境保護和化工等領域有非常廣闊的應用前景和應用潛力。

1　材料和方法

1.1　篩選培養基

1.1.1富集培養基將粉碎的秸稈裝入150 mL三角瓶中，每瓶5 g，加7.5 mL無機鹽溶液，封口膜封口，121 ℃滅菌1.5 h。

無機鹽溶液：(NH4)2SO43.000 0 g、FeSO4·7H2O 0.005 0 g、KH2PO41.000 0 g、MnSO4·H2O 0.001 6 g、MgSO4·7H2O 0.500 0 g、ZnSO4·7H2O 0.001 7 g、CaCl2·H2O 0.114 0 g、CoCl20.002 0 g、NaCl 0.100 0 g、蒸餾水1.000 0 L。

1.1.2綜纖維素培養基次氯酸鈉脫除木質素法：稱取一定量的原料，加入pH值為4.2～4.7的次氯酸鈉溶液，在75 ℃下處理2 h，然后用清水洗至中性，烘干得到綜纖維素。

加濃的Mandels鹽溶液：KH2PO43.0 g、(NH4)2SO42.0 g、尿素0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.5 g、FeSO4·7H2O 1.5 mg、MnSO4·H2O 2.5 mg、ZnSO42.0 mg、CoCl 3.0 mg，pH值約5.5。

1.1.3濾紙條培養基在加濃的Mandels鹽溶液中添加 20 g 瓊脂，倒好平板后鋪1片濾紙片在培養基上。

濾紙處理：使用前將其用1%醋酸溶液浸泡24 h以除去淀粉，用碘檢驗，再用2% NaHCO3溶液洗至中性曬干。

1.1.4羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養基CMC-Na 15.0 g、NH4NO31.0 g、酵母粉1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0 g、ddH2O 1.0 L、瓊脂20.0 g，pH值自然。

1.1.5微晶纖維素培養基下層：在加濃的Mandels營養鹽溶液中加入2%瓊脂。上層：在加濃的Mandels鹽溶液中加入1.5%球磨微晶纖維素粉(微晶纖維素用2 mm玻璃珠 200 r/min 振蕩24 h)、2%瓊脂。于9 cm平皿中倒入下層培養基約15 mL，待凝固后加入上層培養基，使其成為均勻的薄層備用。

1.1.6馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基馬鈴薯200 g或葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 L，pH值自然。

馬鈴薯去皮，切成塊，煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.1.7復篩培養基稻草粉2.30%、蛋白胨0.30%、硫酸銨 0.20%、酵母膏0.05%、KH2PO40.40%、CaCl2·2H2O 0.03%、MgSO4·7H2O 0.03%。

試驗所有化學品和試劑均為分析純。

1.2　菌種的分離和純化

土壤樣品采自長白山自然保護區和柴垛附近。把樣品裝到無菌采樣袋中，標記并保存在4 ℃冰箱中，做進一步的分析工作。將土壤樣品在富集培養基中28 ℃培養7 d，并連續轉接3次，1式3份[7]。用PDA培養基進行分離菌株，把所有分離的菌株接種到PDA斜面上后，在4 ℃下保存。然后，用綜纖維培養基[8]、濾紙條培養基[9]、CMC-Na培養基[10]和微晶纖維素培養基[11]的方法對分離的菌株進行篩選。

為了使透明水解圈清晰可見，筆者所在實驗室采用雙板法，先在培養皿中鋪上1層固體透明的基本瓊脂培養基，待其凝固后再鋪上1層薄薄的含綜纖維素的培養基，既保證了培養基的篩選選擇性，又不至于太難篩選到需要的菌株。將分離得到的單菌落接種于CMC-Na平板上，28 ℃培養4 d后取出，倒入適量配制好的1 mg/mL剛果紅溶液，放置30 min后，用蒸餾水溫和漂洗，最后倒入適量1 mol/L NaCl溶液，放置30 min。以透明圈直徑和菌落直徑的比值為標準，初步判斷各個菌落產纖維素酶的能力。

1.3　分子鑒定分離的真菌

形態結構及生理生化特征的鑒定，采用點種法在PDA培養基上觀察菌落形態。ITS序列鑒定：以提取所述菌株的基因組總DNA為底物，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)為正向引物、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)為反向引物對菌株進行18S rDNA擴增。PCR在Taq酶說明書[天根生化科技(北京)有限公司]的標準條件下進行。將該PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測得序列與NCBI數據庫進行比對分析，選取同源性較高的模式菌株進行系統發育分析，借助MEGA 6.06軟件構建系統發育樹[12]。

1.4　酶活性的測定

對固體發酵培養基進行酶活性測定。向培養基中加入一定體積的蒸餾水，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩浸提1 h，濾紙過濾，10 000 r/min離心15 min。將澄清的上清液用作粗酶液[13]。

羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，簡稱CMCase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，簡稱β-Gase)活性的測定：在試管中加入 1 mL 底物[1% CMC-Na或0.5%水楊素檸檬酸緩沖溶液(pH值4.8)]及1 mL粗酶液，50 ℃保溫 30 min，取出，加入 2 mL DNS試劑，煮沸5 min，冷卻后稀釋5倍，搖勻，530 nm處測定吸光度，并從標準曲線上查出相應的葡萄糖含量折算成酶活性單位(U/g)。

濾紙酶(filter paper lyase，簡稱FPase)活性測定：于試管中加入1.0 mL檸檬酸緩沖液(pH值4.8)，Whatman No.1濾紙片[1 cm×6 cm，(50±1) mg]1片，以及1 mL粗酶液，50 ℃ 保溫 60 min，取出，加入2 mL DNS試劑，其他步驟同CMC酶活性測定。

酶活性單位定義：在纖維素酶最適反應條件下，1 min水解纖維素底物產生1 μg還原糖的量定義為1個酶活性單位，用U/g表示。

1.5　生產纖維素酶工藝參數的優化

對各種工藝參數，如發酵時間(24～168 h)、培養基初始pH值(3～8)、培養溫度(20～45 ℃)、接種量(0.5～3.0 mL/3 g 底物)、料水體積比(1.0 ∶1.0～1.0 ∶3.5)、底物粒徑、不同氮源(硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏)等[14]進行優化。

2　結果與分析

2.1　菌株的鑒定

大多數真菌一直使用傳統的分類學和肉眼觀察進行鑒定[15]。從土壤中分離出1株產纖維素酶菌株，命名為ZH1，將該菌株在PDA培養基中28 ℃培養7 d進行形態的鑒定。該菌株的營養體為綠色的菌絲體，菌絲各細胞之間有橫隔膜，分生孢子梗頂端呈特殊的對稱或不對稱的掃帚狀。這些結果表明，這種生產纖維素酶的真菌是青霉菌。由于18S rDNA序列被廣泛使用，筆者所在實驗室對這種纖維素酶生產菌株的18S rDNA基因進行測序[16]。該菌株的18S rDNA基因序列為551 bp，與NCBI數據庫進行比對，由圖1可知，ITS序列與ZH1相似性最高的菌株均屬于青霉菌屬(Penicillium)，該菌株與Penicilliumochrochloronstrain IHB F 2914的18S rDNA序列有較高的同源性。因此，鑒定菌株為赭綠青霉(Penicilliumochrochloron)。

2.2　時間對菌株ZH1生產纖維素酶的影響

由圖2可知，在72 h有最大的濾紙酶(FPase)活性，在 48 h 時有最大的CMCase、β-Gase活性。Qaisar等認為，細胞生長能增加抑制酶的生產[17]。因此，生產纖維素酶的最佳培養時間為3 d，進一步培養會增加菌種培育期導致酶活性降低。酶活性的降低可能是由pH值的變化或在發酵過程中細胞代謝導致酶的變性所致[18]。

2.3　初始pH值對菌株ZH1生產纖維素酶的影響

發酵培養基的pH值在發酵過程中對微生物生長產酶有顯著的影響，每種微生物的生長均具有最佳的pH值范圍。絲狀真菌在pH值為3～8的范圍內能夠良好地生長，極端pH值(過高或過低)可能會導致微生物死亡[19]。由圖3可知，在培養基初始pH值為4時有最大的FPase活性和β-Gase活性，CMCase活性最大時pH值為5。這項研究結果與Irfan等利用固態發酵生產羧甲基纖維素酶最佳培養基初始pH值為5的報道[20]相一致。有報道顯示，生產β-Gase的最佳pH值為5.0[21]或5.5[22]。

2.4　溫度對菌株ZH1生產纖維素酶的影響

培養溫度是影響糖化發酵生產酶的一個重要因素[6]。由圖4可知，當溫度為30 ℃時，FPase、CMCase、β-Gase都有最大的活性。在發酵過程中不同的真菌生產纖維素酶的最佳溫度范圍為25～45 ℃[18，23]。

2.5　接種量對生產纖維素酶的影響

使用最佳料水體積比，接種量分別調節至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/3 g以研究其對生產纖維素酶的影響。由圖5可知，接種量為0.5 mL/3 g時有最大的FPase、CMCase、β-Gase 活性。酶產量隨著接種量的增加而下降。因此，接種量是生產纖維素酶的一個重要因素。Huang等報道，產酶情況與菌株的生長相關，接種量影響纖維素酶的活性[24]。Raza等通過用麥麩作為底物接種2 mL/10 g黑曲霉和米曲霉的孢子懸浮液，獲得最高的β-Gase活性[22]。

2.6　料水體積比對生產纖維素酶的影響

對于固態發酵，真菌喜歡生活在適當潮濕的環境，有利于它們的成長和酶的生產。本試驗以稻草為主要底物，研究不同料水體積比對生產纖維酶的影響。由圖6可知，1.0 ∶3.0的料水體積比適合生產CMCase、FPase，1.0 ∶2.5的料水體積比適合生產β-Gase。在固態發酵中過多或過少的水量都會影響纖維素酶的生產，維護適當的水分是非常重要的，因為它會影響底物孔隙大小最終影響氧的移動[21]。Mehboob等報道，白腐真菌最佳生產纖維素酶的料水體積比為1 ∶3[25]。綠色木霉使用麥草作為底物生產CMC酶的最優含水量為40%[20]。

2.7　稻草粉底物粒徑對生產纖維素酶的影響

底物的粒徑(比表面積)對微生物生長非常重要，因為它在糖化發酵過程中傳遞熱與能量[26]。在本試驗中使用不同粒徑的稻草粉，研究其對生產纖維素的影響。由圖7可知，當底物粒徑為0.250～0.425 mm 時，比其他尺寸生產的酶活性高。小的粒子激發真菌的生長，因為它提供了較大的表面積，有利于微生物的營養攝取，但會降低傳熱及氧氣與二氧化碳的交換。較大底物粒徑(0.850 mm)時，真菌生長被限制，由于表面面積小導致酶生產的降低[27]。這表明稻草粉粒度對菌株生產纖維素酶具有明顯影響。

2.8　氮源對生產纖維素酶的影響

氮源是影響菌株產酶的重要因素之一[28]。不同有機和無機氮源(酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、花生餅粉)的存在能明顯影響酶的生產。如圖8所示，添加花生餅粉到培養基中，有最大的FPase酶活性。培養基中添加硝酸鈉有利于CMCase生產，而添加硫酸銨有利于β-Gase的生產。在這項研究中，有機氮源和無機氮源對酶活性的影響與前人的研究結果[29]相一致。宋賢沖等的研究報告指出，蛋白胨作為氮源最適合綠色木霉生產CMCase[30]。

3　結論與討論

赭綠青霉菌ZH1菌株固體發酵生產纖維素酶時，在自然補給氧氣的條件下，對培養基及培養條件的優化結果為培養基pH值為4，并保持料水體積比為1.0 ∶3.0，最佳氮源為花生餅粉，接種量為0.5 mL，稻草底物粒徑為0.250～0.425 mm，有利于纖維素酶活性的提高；在此條件下72 h是適宜的發酵周期。

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