Aurora A調控活性氧對卵巢癌順鉑耐藥的影響

楊麗娜，楊宇琦，楊　恭，陳亞萍

1.復旦大學附屬上海市第五人民醫院婦產科，上海 200240；2.復旦大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；3.復旦大學附屬上海市第五人民醫院中心實驗室，上海 200240

化療耐藥是卵巢癌臨床治療的一大難題，研究細胞耐藥機制并開發靶向藥物可明顯提升腫瘤的治療效果。極光激酶A（Aurora A kinase，Aurora A）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，參與調控細胞有絲分裂過程。Aurora A擴增導致多極紡錘體和非整倍體細胞的形成，誘導基因不穩定性從而促進腫瘤發生［1］。有研究表明，Aurora A可通過調控DNA損傷修復、抑制細胞凋亡及抑制自噬等多種途徑促進細胞對化療藥物（如順鉑、紫杉醇及依托泊苷）的耐藥［2-4］。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要由含氧自由基和易于形成自由基的過氧化物組成。ROS作為信號分子，可調節細胞增殖、分化及免疫反應等［5］。腫瘤細胞內ROS水平高于正常細胞，因此，誘導ROS升高的分子可用于腫瘤的靶向治療［6］。在順鉑、紫杉醇和多柔比星耐藥的卵巢癌細胞株中，ROS清除酶谷胱甘肽過氧化物酶3（glutathione peroxidase 3，GPX3）上調，氧化應激誘導基因UDP-葡萄糖醛酸轉移酶家族1成員A6（UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6，UGT1A6）下調［7］，提示耐藥細胞株中ROS水平低于敏感細胞株。

在骨肉瘤中，Aurora A抑制劑MLN8237促進細胞凋亡和自噬，同時MLN8237誘導ROS生成［8］；在慢性粒細胞性白血病中，Aurora A抑制劑AKI603通過誘導衰老從而逆轉細胞的耐藥性，此過程伴隨ROS的升高［9］，表明Aurora A抑制劑可誘導ROS產生。但Aurora A蛋白對細胞內ROS的調控及ROS在Aurora A介導的化療耐藥中的作用仍不明確。

本研究利用慢病毒感染的方式在人卵巢癌細胞中分別導入Aurora A cDNA和shRNA，構建Aurora A過表達和沉默的穩轉細胞系，利用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2’, 7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和蛋白［質］印跡法（Western blot）等探討ROS在Aurora A介導的化療耐藥中的作用，為卵巢癌的臨床用藥提供參考。

1　材料和方法

1.1　材料和主要試劑

人卵巢癌細胞株HEY、OVCA429、A2780和OVCA420購自美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC），A2780順鉑耐藥株A2780/CDDP為課題組自備。病毒包裝細胞HEK293T購自ATCC。RPMI-1640培養基和DMEM培養基購自美國Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco公司，Aurora A抗體、CDK6抗體、p-AMPKα（Thr172）抗體和AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）抗體購自美國CST公司，GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體購自美國Sigma公司，二抗購自美國Sigma公司，DCFH-DA染液購自北京普利萊基因技術有限公司，MTT和順鉑購自美國Sigma公司，N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）購自生工生物工程（（上海）股份有限公司，ECL發光液購自美國Millipore公司。

1.2　實驗方法

1.2.1細胞培養

卵巢癌細胞株的培養選用含10%FBS的RPMI-1640培養基，HEK293T的培養選用含10%FBS的DMEM培養基，細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的飽和濕度的細胞培養箱中培養。

1.2.2構建穩定轉染細胞系

構建穩定轉染細胞系的方法參照參考文獻［2］。shAurora A靶向序列為：5’-GUCUUGUGUCCUUCAAAUU-3’。分別構建Aurora A過表達細胞株OVCA420 Aurora A及對照細胞株OVCA420 Vector，Aurora A沉默細胞株OVCA429 shAurora A及對照細胞株OVCA429 shGFP。

1.2.3采用Western blot檢測蛋白水平

接種等量細胞于6 cm培養皿中，培養48 h后收集細胞。用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑）裂解得到全細胞蛋白，經蛋白定量后加入上樣緩沖液配成相同濃度的蛋白樣品，100 ℃，煮樣5 min。取30 μg蛋白樣品進行Western blot檢測。經轉膜、封閉后加入一抗溫育過夜。洗滌后，加入二抗，室溫溫育1 h，洗滌去除非特異結合后，利用ECL發光液進行顯影。顯影儀器為FlourChem E。

1.2.4采用DCFH-DA法檢測細胞內ROS含量

接種等量細胞于12孔板中，培養過夜后，加入10 μmol/L DCFH-DA染液，37 ℃避光溫育30 min。用1×PBS清洗細胞，并在熒光顯微鏡下拍照記錄。

接種等量細胞于酶標板中，培養過夜后，加入10 μmol/L DCFH-DA染液，37 ℃避光溫育30 min。用1×PBS清洗細胞，并在多功能酶標儀中讀取熒光值，激發波長502 nm，發射波長530 nm。

1.2.5采用MTT法檢測順鉑的IC50

取對數生長期細胞，按1×104個細胞/孔接種于96孔板中，培養過夜。按指定濃度加入順鉑和NAC，溫育48 h后小心棄上清，每孔加入180 μL培養基和20 μL MTT（5 mg/mL），溫育4 h后，棄上清，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），溫育10 min，利用酶標儀檢測490 nm波長下各孔的吸光度（D）值，并利用Graphpad Prism計算半數抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）。

1.2.6培養基pH值測定

接種等量細胞于6 cm的細胞培養皿中，分別在培養24和48 h時收集細胞培養基于15 mL離心管中，利用pH計測定培養基的pH值［10］。

1.3　統計學處理

采用Graphpad Prism進行數據統計及作圖，結果以x±s的形式表示，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1　細胞內ROS與順鉑耐藥

利用細胞內ROS特異性染液DCFH-DA檢測，發現與卵巢癌細胞株A2780相比，順鉑耐藥株（A2780/CDDP）的細胞內ROS水平降低（圖1A、B），提示在卵巢癌中順鉑耐藥與ROS的降低有關。在A2780和A2780/CDDP中加入ROS清除劑NAC（5 mmol/L），降低細胞內ROS含量后，利用MTT法檢測順鉑的IC50，發現NAC促進細胞對順鉑的耐藥（圖1C、D），說明降低細胞內ROS促進細胞對順鉑耐藥。

2.2　Aurora A在卵巢癌細胞株中的表達及穩定轉染細胞株的鑒定

Western blot檢測Aurora A在4種常見卵巢癌細胞株HEY、OVCA420、A2780和OVCA429中的水平，發現Aurora A在HEY和OVCA429中高表達，而在OVCA420和A2780中低表達（圖2A）。因此，在OVCA420中導入Aurora A cDNA，構建Aurora A過表達細胞株，即OVCA420 Aurora A，對照組細胞導入空載體，即OVCA420 Vector；在OVCA429中導入Aurora A shRNA，構建Aurora A沉默細胞株，即OVCA429 shAurora A，對照細胞組導入靶向GFP的shRNA，即OVCA429 shGFP。Western blot檢測Aurora A及Aurora A下游蛋白細胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）的表達，發現導入Aurora A cDNA后，Aurora A和CDK6的表達明顯升高，而導入Aurora A shRNA降低了Aurora A和CDK6的表達（圖2B），說明Aurora A過表達和沉默細胞株構建成功，可用于下一步實驗。

2.3　Aurora A調控細胞內ROS

DCFH-DA法檢測穩轉細胞的細胞內ROS，發現與對照組相比，Aurora A 過表達，ROS降低；而Aurora A沉默后，ROS升高（圖3A、B），說明Aurora A可調節細胞內ROS的變化。

圖1　A2780和順鉑耐藥株A2780/CDDP的ROS含量和順鉑的IC50Fig. 1　ROS and IC50 of cisplatin in A2780 and A2780/CDDPA: ROS levels were observed under a fluorescent microscope; B: ROS levels were examined by a multimode reader; C: IC50 values of cisplatin were detected by MTT; D: Statistical analysis of IC50; *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.000 1

圖2　Aurora A的表達及Aurora A過表達/沉默細胞系的鑒定Fig. 2　Expression of Aurora A in ovarian cancer cells and validation of Aurora A in established cell linesA: Detection of the basal level of Aurora A in ovarian cancer cell lines; B: Validation of Aurora A in established overexpresson or knockdown cell lines

2.4　抑制細胞內ROS促進Aurora A介導的順鉑耐藥

Aurora A過表達，ROS降低，細胞對順鉑耐藥，加入NAC進一步降低ROS后，增強細胞對順鉑的耐藥性（圖4A、B）；Aurora A沉默，ROS升高，細胞對順鉑敏感，加入NAC降低ROS后，促進了細胞對順鉑耐藥（圖4C、D）。表明ROS參與Aurora A調控的順鉑耐藥。

2.5　Aurora A抑制ROS的分子機制

信號轉導通路檢測發現，Aurora A過表達促進AMPK第172位蘇氨酸（Thr172）的磷酸化，而Aurora A沉默后，AMPK磷酸化水平降低（圖5A）。AMPK磷酸化可增強細胞對葡萄糖的攝入，促進糖酵解，抑制ROS生成［11］，提示過表達Aurora A可能促進糖酵解過程。進一步檢測發現，糖酵解關鍵酶類甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）受Aurora A調控，Aurora A過表達，GAPDH表達升高（圖5A）。糖酵解過程中葡萄糖被代謝生成乳酸，而細胞培養基中酚紅可指示培養基的酸堿度變化，發現細胞培養過程中Aurora A過表達導致細胞培養液由紅色轉變為黃色（圖5B）。分別收集24和48 h的細胞培養液進行檢測，結果顯示，Aurora A過表達，培養液酸度增強（pH明顯降低），而Aurora A沉默，酸度減弱（圖5B、C）。上述結果表明，Aurora A促進糖酵解過程，抑制ROS。

圖3　Aurora A過表達/沉默細胞中ROS水平Fig. 3　ROS levels in Aurora A overexpression or knockdown cell linesA: ROS levels were observed under a fluorescent microscope; B: ROS levels were examined by a multimode reader; **: P<0.01; ***: P<0.000 1

圖4　抑制ROS促進細胞對順鉑的耐藥性Fig. 4　Inhibition of ROS promotes chemo-resistanceA: IC50 cisplatin values of cisplatin in OVCA420 cell lines detected by MTT; B: Statistical analysis of IC50 values in OVCA420 cell lines; C: IC50 values of cisplatin in OVCA429 cell lines detected by MTT; D: Statistical analysis of IC50 values in OVCA429 cell lines; *: P<0.05; **: P<0.01; ***:P<0.000 1

圖5　Aurora A促進AMPK磷酸化及糖酵解Fig. 5　Aurora A promotes phosphorylation of AMPK and stimulates glycolysisA: Aurora A activates AMPK and upregulates GAPDH; B. pH changes of cell culture supernatants after incubation for 48 h; C: Statistical analysis of pH after incubation for 24 and 48 h

3　討　論

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，在治療過程中容易產生化療耐藥，導致腫瘤復發。腫瘤細胞內的ROS水平高于正常細胞，因此，誘導ROS升高可作為腫瘤治療的候選策略［6］。有研究表明，耐藥細胞株中ROS水平較其對照細胞株明顯降低［12］。檢測卵巢癌順鉑耐藥株A2780/CDDP和對照組細胞A2780中的ROS，發現順鉑耐藥株中ROS降低，提示ROS在卵巢癌的順鉑耐藥中發揮重要作用。

以往研究發現，Aurora A抑制劑可誘導細胞內ROS升高，但Aurora A蛋白對ROS的調控目前并不清楚。本研究利用病毒感染的方式外源性導入Aurora A cDNA和shRNA，構建Aurora A過表達/沉默細胞株，檢測Aurora A對細胞內ROS的影響。結果表明，Aurora A過表達，ROS降低；Aurora A沉默，ROS升高。加入ROS清除劑NAC后，細胞內ROS下降，順鉑的IC50增大，表明抑制ROS可促進細胞對順鉑的耐藥。

AMPK受細胞內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量調控，當AMP與ATP的比值升高時，AMPK發生磷酸化活化，增強細胞的葡萄糖攝取及加速糖酵解代謝［13］。此外，AMPK還可通過調控FOXO轉錄因子，促進抗氧化酶類如SOD、CAT，從而降低ROS水平［14］。有研究發現，在肝癌細胞中導入Aurora A shRNA，細胞內ATP含量降低，糖酵解相關基因ALDOC、GLUT1、GLS、PDK1、PFK1、PFKM和RPL23 mRNA顯著降低［15］，提示Aurora A沉默后，糖酵解途徑也受到抑制。本研究結果表明，Aurora A激活AMPK，上調糖酵解酶類GAPDH，并導致細胞培養液酸度增強，說明Aurora A促進糖酵解過程。細胞代謝向糖酵解轉變可抑制細胞內ROS的生成［16］，提示Aurora A抑制ROS可能與AuroraA促進糖酵解有關。此外，AMPK介導的抗氧化機制在Aurora A抑制ROS的過程中是否發揮作用仍需進一步實驗驗證。

綜上所述，在卵巢癌中過表達Aurora A降低了細胞內ROS水平；Aurora A沉默，升高細胞內ROS；并且ROS的降低促進了卵巢癌對順鉑的耐藥性。而Aurora A抑制ROS與AMPK介導的能量代謝方式的轉變有關。

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