氨基酰化酶-1在肝癌組織中的表達及其臨床意義＊

黃驛勝，王競楓，林 楓，葉啟文，李林立，張代場

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一。目前，我國HCC患者約占全球的 55%，已成為發病率最高的國家［1，2］。 肝癌的發生與遺傳、環境等多種因素相關，如肝炎病毒感染、黃曲霉素的攝入、寄生蟲感染、氯仿等。其中，大多數肝癌的發生都是由肝炎病毒（HBV、HCV）的感染造成的［3］。HCC發病機制隱匿，早期診斷困難，進展期快，惡性度高，術后高復發，預后性差給社會和醫療體系造成了巨大的負擔。不少患者在就診時腫瘤已經發展到了中晚期，失去了最佳治療機會，即使是接受了手術，預后依然很差，5年總體生存期仍不理想［4］。因此，如何更加有效地防治HCC成為進一步提高患者生存率的主要問題。

氨基酰化酶-1（ACY-1）是一種含鋅金屬酶，廣泛分布于各種組織，基因定位于3p21［5］。ACY-1主要參與生物體內氨基酸代謝，專一水解N-酰基-L-氨基酸的酰胺鍵形成L-氨基酸，而L-氨基酸參與機體代謝過程，具有生理活性［6-8］。遺傳性ACY-1表達缺失會造成代謝異常，致使神經系統出現癥狀，表現為尿液中N-乙酸氨基酸的檢出增加。ACY-1在不同腫瘤組織中的表達趨勢也有所不同。在腎癌、肺癌、神經母細胞瘤組織中ACY-1表達下調，結直腸癌組織中ACY-1表達上調，而ACY-1在結直腸癌組織中的高表達預示結直腸癌患者預后不良。此外，Mitta和Tsunasawa等通過對大腸癌細胞、小鼠黑色素瘤細胞中ACY-1的表達進行研究發現，ACY-1在抑癌方面有著重要的作用［9］。由此推測ACY-1可能在肝癌的發生發展中起著重要作用，或許是潛在的肝癌預后評估的分子標志物。

為探討ACY-1在肝癌中的表達及其作用，筆者收集手術切除的新鮮肝癌組織及配對癌旁組織，利用qRT-PCR技術和免疫印跡的方法分別對HCC患者的癌組織和相應癌旁組織中的ACY-1 mRNA和蛋白的表達水平進行檢測。另外，同時結合免疫組化的方法，分析了手術切除、病理科存檔的HCC患者石蠟標本中ACY-1蛋白的表達水平及其與臨床病理參數之間的相關性，以期為肝癌的診斷、治療提供依據。

1　資料與方法

1.1一般資料 HCC患者86例，為寧德市閩東醫院肝膽外科2009年—2014年手術切除、病理科存檔石蠟標本，所有患者在手術前均未接受化療和放療。其中男56例，女30例；年齡35~74歲，中位年齡50歲。根據Edmondso四級分級法，將HCC分為Ⅰ~Ⅳ級，Ⅰ、Ⅱ級為高分化，Ⅲ、Ⅳ級為低分化。其中，高分化56例，低分化30例；腫瘤直徑＜5 cm 48例，直徑≥5 cm 38 例；AFP （ng/ml）≥20 ng/ml 58例，AFP（ng/ml）<20 ng/ml 28例；配對的癌旁組織86例，取距腫瘤病灶邊緣至少2 cm以外肝組織。

另收集寧德市閩東醫院肝膽外科2014年—2015年手術切除的新鮮肝癌組織標本30例。HCC患者術前未接受其他治療措施，HCC組織標本均經術后病理學確診為原發性HCC，配對的癌旁組織取至距腫瘤邊緣至少2 cm以外肝組織。組織標本離體后立刻存儲于液氮，并記錄患者臨床信息，如年齡、性別、組織學分級、AFP水平等。樣品采集遵循法律和倫理委員會準則，并取得患者知情同意。

1.2主要儀器與試劑 高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）；PCR 儀（Eppendorf，德國）；Bio-Rad 電泳系統 （Bio-Rad，美國）；凝膠成像系統（Bio-Rad，美國）；熒光定量 PCR 儀（Roche 480）；Trizol（Invitrogen，美國）；RNase-free 水（Takara，中國大連）；2×Taq PCR MasterMix（全式金，北京）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，中國大連）；SYBR○RPremix Ex TaqTMII （Tli RNase HPlus），Bulk（Takara，中國大連）；BCA 定量試劑盒（凱基生物，南京）；ACY-1 抗體（abcam，美國）；抗β-actin 單克隆抗體（Sigma，美國）。

1.3方 法

1.3.1引物的設計與合成 根據文獻設計引物序列并由上海生工生物工程公司合成。具體引物序列如下：β-actin上游引物 5'-TTGTTACAGGAAGTC CCTTGCC-3'，β-actin 下游引物 5'-ATGCTATCAC CTCCCCTGTGTG-3'；ACY-1上游引物 5'-GGCTG CATGAGGCTGTGTT-3'，ACY-1下游引物 5'-CTT GGCACTGGTTGGGATG-3'。

1.3.2RNA的提取與反轉錄 取標本50 mg，加入液氮研磨成粉末，Trizol裂解后繼續不斷研磨至液體。經氯仿分層、異丙醇沉淀及75%乙醇溶液洗滌干燥后，用適量DEPC水溶解RNA沉淀。取1 μl溶液用NanoDrop 1000超微量分光光度計測RNA濃度及純度，然后進行cDNA的合成和RNA的電泳。按照TaKaRa試劑盒的操作步驟去基因組DNA后進行反轉錄。配制反轉錄反應體系，模板RNA 1 μl加入反應體系后，37 ℃孵育 15 min，85℃孵育5 min。反轉錄產物置于-20℃。

1.3.3實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR利用SYBR○RGreen qPCR進行檢測，β-actin為內參。反應體系為：20 μl：Ex Taq（2×）10 μl，PCR Forward Primer （10 μM）0.8 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）0.8 μl，DNA 模板 2 μl，ddH2O 6.4 μl。反應設三復孔。反應條件：預變性95℃ 30 sec；PCR 95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，45 個循環；融解 95℃5 sec，60 ℃ 1 sec；降溫 50 ℃ 30 sec。 利用 2-△△Ct法計算分析ACY-1mRNA相對表達量。

1.3.4蛋白提取 取大約300 mg樣本，研磨后，按1∶5（V/W）的比例加入含有1×蛋白水解酶抑制藥的TBS （Tris HCl 50 mmol/L pH7.4；EDTA 2 mmol/L；NaCl 150 mmol/L），將勻漿液超聲破碎處理3 min。然后，加入等體積含1×蛋白酶抑制藥的0.2%十二烷基硫酸鈉溶液（SDS），4℃12 000 rpm離心1 h，收集上清并分裝后于-80℃保存。

1.3.5蛋白濃度測定 利用BCA Protein Assay Kit進行蛋白濃度測定，配置工作液，稀釋標準品至不同濃度梯度，同時稀釋ACY-1蛋白樣本10倍待用。將樣品及標準品加入96孔板后加入工作液，65℃孵育30 min后，酶標儀測定A562 nm，根據標準曲線計算蛋白濃度。

1.3.6Western blot分析 灌制分離膠和濃縮膠，加電泳緩沖液后上樣，電泳后將蛋白轉印于NC膜。3%脫脂奶粉封閉后加入一抗：ACY-1抗體（1∶5000）和 β-actin 抗體（1∶5000）；4 ℃過夜后洗膜，加入二抗37℃孵育1 h。洗膜后加入ECL顯影，用凝膠圖像分析儀掃描照片。最后用image-plus軟件測量灰度值做統計分析。

1.3.7免疫組化分析 肝組織標本經10%福爾馬林固定、石蠟包埋后制片；免疫組織化學以SP法進行。DAB顯色，蘇木素復染后封片。在高倍鏡下隨機選取5個視野，當胞質棕黃色染色強度高于背景非特異染色時判斷為陽性染色細胞。

1.3.8統計學分析 采用SPSS統計軟件分析處理數據，各組數據以（x±s）表示。采用方差分析比較各組之間的差異顯著性，并進行等級相關分析，p＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1ACY-1 mRNA和ACY-1蛋白在HCC組織中的表達 利用qRT－PCR檢測30對肝癌組織及配對癌旁組織中ACY－1 mRNA的表達水平，結果顯示：肝癌組織中ACY－1 mRNA的表達水平明顯低于配對癌旁組織 （圖1）。同時，又利用Western blot方法檢測了8對肝癌組織及配對癌旁組織中ACY－1的表達水平，并采用Image J圖像分析軟件掃描測定光密度值，而后與內參β－actin光密度值相比，得出相對值（圖2）。結果表明：肝癌組織中ACY－1蛋白表達水平也明顯低于配對癌旁組織。

圖1　HCC組織及配對癌旁組織中ACY-l mRNA的表達

圖2　Western Blot檢測ACY-l蛋白在HCC組織及配對癌旁組織中的表達

2.2免疫組化分析HCC組織中ACY-1的表達利用免疫組化方法檢測86對HCC組織及其配對癌旁組織中ACY－1蛋白的表達。ACY－1蛋白陽性表達為黃色或棕黃色顆粒，根據陽性細胞比例和染色強度計分，將肝癌組織分為ACY－1高表達組（評分“強”）和低表達組（評分“弱”或“中”）。結果發現：HCC組織中ACY－1表達陽性率低于癌旁組織且具有顯著差異，這與Western Blot結果一致（圖3）。另外，分析ACY－1蛋白表達水平與HCC患者的臨床病理參數之間的相關性發現，ACY－1蛋白表達水平與AFP水平密切相關，但與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度、HBV感染因素無關（表1）。

圖3　免疫組化檢測ACY-1蛋白在HCC組織和癌旁組織中表達

表1　ACY-1蛋白表達與HCC臨床病理特征關系

3　討論

肝細胞癌（HCC）是一種常見的惡性腫瘤，死亡率位居世界惡性腫瘤的前三位，其發病率高，惡性程度高，浸潤和轉移性強，預后差。我國是肝癌的高發國家，HCC死亡人數約占世界的1/2以上，究其原因之一是患者未能盡早發現并及時治療，不同分期的HCC療效和預后有很大的差異。成人肝細胞受損時，肝干細胞可分化為肝細胞和膽管細胞，而干細胞的子代有合成AFP的能力，也有發展為腫瘤細胞的可能性，故AFP廣泛應用于HCC的普查和診斷，是一種特異的篩查和診斷HCC的腫瘤標志物，它與影像學檢查相結合可以早期發現 HCC。正常人血清AFP參考值為0～7 ng/ml，臨床上一般以20 ng/ml作為評價標準。

一部分肝炎或肝硬化患者AFP輕度升高，但一般不會超過200 ng/ml［10］。肝硬化是肝癌發生的主要病因。如以AFP＞20 ng/ml為標準，急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化的AFP陽性率分別為31%～52%、5%～58%和11%～47%。血清AFP為400 ng/ml是HCC的臨界值。當AFP介于20～400 ng/ml時，若連續監測有持續升高的趨勢，對HCC的診斷也有價值［11］。雖然AFP在腫瘤的早期篩查和治療中有重要的作用，但仍有30%～40%的HCC患者的AFP陰性，并且近年來AFP陰性或低滴度AFP的HCC患者逐漸增多；另外病毒性肝炎活動期或肝硬化等因素也會導致 AFP 假陽性［12，13］。因此，尋找特異性的 HCC生物學標志物或特定的治療靶點對HCC的治療及預后有著重要意義。

ACY－1是一種廣泛分布于各種組織的胞質酶，主要參與生物體內氨基酸代謝，專一水解N－酰基－L－氨基酸的酰胺鍵形成L－氨基酸，而L－氨基酸參與機體代謝過程，具有生理活性。遺傳性ACY－1表達缺失會造成代謝異常，從而導致神經系統癥狀。ACY－1在許多腫瘤疾病，如小細胞肺癌，腎細胞癌，直腸癌及神經母細胞瘤中的表達都被廣泛報道［14］，在肺癌和腎癌中ACY－1被報道為一種抑癌基因，但其在肝癌中鮮有報道。腫瘤組織中ACY－1表達水平與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移和血管侵犯密切相關。腎癌中，利用小干擾RNA技術沉默ACY－1表達后，HCT116細胞增殖能力減弱，凋亡細胞比例增加。ACY－1可以被分泌到外周血中，但大部分的腎移植受者在移植前及后的血清中ACY－1很難被檢測到。而高達65%的發生移植腎功能延遲恢復的移植受者，血清中的ACY－1會顯著升高，因此ACY－1可以作為腎移植長期預后評判的重要血清標志物。這提示，ACY－1也可能同樣有作為HCC血清分子標志物的潛在應用價值。

該研究結果顯示，相對于配對癌旁組織，HCC組織中的ACY－1 mRNA表達下調。同mRNA表達趨勢一致，Western Blot結果也表明，ACY－1蛋白在肝癌中的表達低于癌旁組織。這與之前在小細胞肺癌和腎癌中的報道一致［15］，但與ACY－1在結直腸癌中的報道不同。結直腸癌組織中ACY－1的表達則上調，而ACY－1在結直腸癌組織中的高表達預示著結直腸癌患者的預后不良。ACY－1的缺失可能參與了肝癌發生發展并起到促進作用。有研究報道，ACY－1可以聯合CD34和泛素樣結合蛋白p62（sequestosome 1）作為區分小肝細胞癌和增生性結節的潛在免疫組化標志物［10］。 另外，ACY－1聯合sequestosome－1和glypican－3也可以區分高分化肝癌和增生性結節［10］。因此試驗中結合免疫組化的方法，對手術切除、病理科存檔的HCC患者石蠟標本中ACY－1蛋白的表達水平及其與臨床病理參數之間的相關性進行分析，發現癌旁組織中ACY－1蛋白水平明顯高于肝癌組織。與此同時，ACY－1蛋白的表達水平與血清中AFP的水平密切相關，但與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度及HBV感染因素無關。提示不同年齡、不同性別的HCC組織中的ACY－1的表達沒有特異性；同時ACY－1的表達與患者腫瘤大小、組織分化程度無關，提示其與肝癌進展情況及惡性程度無關。另外，由于AFP的陽性率只有60%左右，而在部分AFP正常（＜20 ng/ml）的HCC患者中也存在ACY－1基因的低表達，或許ACY－1作為肝癌腫瘤標志物的診斷價值需要以正常人群作為對照進行研究。

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