體外循環期間Th1、Tc1/Th2Tc2細胞亞群與機體致炎/抗炎反應的關系

倪海峰，肖穎彬

免疫功能失調是導致體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）創傷及術后并發癥的原因之一，對其致病機制、臨床救治的研究是心外科領域的重要課題。T細胞是機體重要的免疫調節效應細胞，CPB對Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞功能亞群分化狀態的影響目前研究尚少。筆者對臨床CPB病例T細胞Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞功能亞群變化及與機體致炎/抗炎反應變化關系進行觀察，報告如下。

1　資料與方法

1.1研究對象 2015年3月—2016年12月，選取二尖瓣瓣膜病患者20例作為試驗組，年齡31～55歲，男10例，女10例；動脈導管未閉患者20例作為對照組，年齡20～39歲，男10例，女10例。納入標準：（1）年齡＞18 歲；（2）診斷明確，欲行 CPB 下二尖瓣置換術或非CPB下動脈導管結扎術；（3）患者知情同意接受該研究。排除標準：（1）有高血壓、冠心病、糖尿病病史，或患有梅毒、乙型肝炎、丙型肝炎者；（2）有活動性感染、風濕活動期、肝腎疾病、慢性阻塞性肺部疾病者；（3）非首次心臟手術患者；（4）術前左心室射血分數＜40%；24 h內發生心絞痛、心肌酶譜升高者；1個月內發生心肌梗死患者；（5）術前1周內服用過影響免疫功能的藥物者。

試驗組于CPB下行二尖瓣置換術，轉流時間62～91 min；對照組于非CPB下行動脈導管結扎術，手術時間65～98 min。于術前、CPB或手術開始20 min、停機前或手術結束時、術后4 h、術后24 h、術后72 h抽取靜脈血。該研究經醫院倫理委員會批準，受試對象及親屬簽署知情同意書，研究過程符合倫理學原則。

1．2 方法 濃度梯度法分離單個核細胞，尼龍柱濾除B細胞，獲取T細胞。提取T細胞RNA，－70℃保存。RNA印跡法檢測T細胞IFN－γ/IL－4mRNA表達。細胞內因子染色、免疫熒光標記檢測T細胞IFN－γ、IL－4蛋白表達。放射免疫試劑盒檢測血清中IL－6、IL－10 濃度變化。

1.3數據處理 GDS8000圖像分析量化，SPSS16．0軟件數據處理，計量資料以均數±標準差 （x±s）表示。符合正態分布，采用配對t檢驗比較組內差異；不符合正態分布，采用非參數分析；重復測量采用方差分析比較組間差異。p＜0．05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1T細胞IFN-γmRNA蛋白表達變化 與術前相比，試驗組CPB停機前IFN－γmRNA蛋白表達水平明顯下調，差異有統計學意義（p＜0．05）；術后 4 h回升，至術后 24 h 基本恢復到術前水平（P＞0．05）。對照組各時相點IFN－γmRNA蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0．05）。 見圖1～4。

圖1　RNA印跡法檢測T細胞內IFN-γmRNA表達變化

圖2　T細胞內IFN-γmRNA表達變化

圖3　表達IFN-γ蛋白的T細胞數量變化（激光共聚焦顯微鏡，400×）

圖4　T細胞內IFN-γ蛋白表達變化

2.2T細胞IL-4 mRNA蛋白表達變化 與術前相比，試驗組CPB停機前IL－4 mRNA蛋白表達水平明顯上調，差異有統計學意義（p＜0．05）；術后 4 h下降，至術后 24 h 基本恢復到術前水平（P＞0．05）。對照組各時相點IL－4 mRNA蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0．05）。 見圖5～8。

2.3IL-6水平變化 與術前相比，對照組手術開始20 min后，IL－6水平明顯升高，差異有統計學意義（p＜0．01）；手術結束后 4 h 達到高峰，差異有統計學意義（p＜0．01）；術后 72 h 基本恢復術前水平（P＞0．05）。試驗組雖同樣出現 IL－6一過性上調，峰值位于術后4 h，但升高幅度明顯低于對照組，差異有統計學意義（p＜0．05）；術后 72 h 基本恢復到術前水平（P＞0．05）。 見圖9。

2.4IL-10水平變化 與術前相比，試驗組CPB開始20 min后，IL-10水平明顯升高，差異有統計學意義（p＜0.05）；停機前達到高峰，差異有統計學意義 （p＜0.01）； 術后24 h基本恢復到術前水平 （P＞0.05）。對照組各時相點IL-10水平差異無統計學意義（P＞0.05）。 見圖10。

圖5　RNA印跡法檢測T細胞內IL-4mRNA表達變化

圖6　T細胞內IL-4mRNA表達變化

圖7　表達IL-4蛋白的T細胞數量變化（激光共聚焦顯微鏡，400×）

圖8　T細胞內IL-4蛋白表達變化

圖9　外周血IL-6表達水平變化

圖10　外周血IL-10表達水平變化

3　討論

CPB創傷及并發癥是重癥心血管外科手術患者面臨的危險因素之一，其致病機制、預防干預與救治研究是心外科領域的重要課題。1999年德國一項對6萬例CPB手術病例的統計分析顯示：CPB術后各種感染性、非感染性并發癥是導致危重患者術后死亡的重要原因之一［1］。

以往研究表明，CPB可引起機體免疫功能發生改變，推測CPB創傷及并發癥與機體免疫功能失調有關。T細胞作為機體重要的免疫調節、效應細胞，可能參與其發生與演變過程，但對CPB中T細胞分類及功能的變化情況，目前研究尚少。

研究認為，輔助 T細胞（Th）由 Th1、Th2兩個細胞亞群組成，具有雙向免疫調節作用，Th1/Th2失衡與多種疾病發生有關系［2-6］。臨床研究也觀察到CPB過程中，由Thl細胞分泌的致炎因子IFN-γ以及Th2細胞分泌抗炎因子IL-10水平發生了顯著變化［7，8］。

進一步研究發現：細胞毒性T細胞（Tc）也可根據分泌的細胞因子譜，分為 Tc1和Tc2兩種細胞亞群。Tc1/Tc2細胞亞群具有類似于Th1/Th2細胞亞群的生物學特征：誘導因素、產生的細胞因子種類、參與的免疫應答類型、分化調節機制等［9，10］。 研究表明：在CD4＋與CD8＋T細胞中，均存在能發揮同樣雙向調節與免疫效應的功能亞群。Tc1與Th1淋巴細胞、Tc2與Th2淋巴細胞，雖然細胞表面標志不同，但從功能和生物學效應上卻可以分別歸為同一個功能亞群。而隨著對T細胞表面標志與生物學效應分子機制的逐步深入研究，以往以細胞表面標志或“效應性T細胞/調節性T細胞”“輔助性T細胞/抑制性T細胞”等傳統方法進行的分類，已因為不能準確反映真實情況而受到挑戰；而根據調節效應、生物學效應進行功能亞群分類，則是描述T細胞功能分類的新方法。

因此，筆者采用免疫印跡雜交、細胞內因子染色、免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡等分子生物學試驗方法，觀察CPB對T細胞內IFN-γ/IL-4mRNA蛋白表達水平影響，了解CPB對Th1、Tc1/Th2、Tc2功能亞群影響。結果顯示：CPB過程中，T細胞內由Th2、Tc2細胞亞群分泌的標志性抗炎介質IL-4 mRNA蛋白表達升高，由Th1、Tc1細胞亞群分泌的標志性致炎介質IFN-γmRNA蛋白表達下調，對照組未觀察到類似變化。這種變化說明CPB中T細胞功能亞群發生變化：分泌致炎因子、誘導細胞免疫的Th1、Tc1細胞減少；分泌抗炎因子、誘導體液免疫的Th2、Tc2細胞增加；T細胞功能亞群分化向Th2、Tc2方向偏移。

筆者從免疫調節角度出發，觀察Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群變化同時，對致炎因子IL-6、抗炎因子IL-10變化進行對照研究。結果表明：對照組IL-6上調，IL-10與 Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群無明顯變化；試驗組有不同表現：（1）IL-6雖較術前仍有升高，但明顯低于對照組表達水平；（2）IL-10明顯上調；（3）T細胞功能亞群分化向Th2、Tc2方向偏移。分析觀察結果：對照組致炎因子IL-6表達上調，是機體非特異性免疫系統（中性粒細胞、補體等）的一種非特異性應激反應，導致炎性細胞活化、炎性介質表達上調，對抗手術創傷；特異性免疫系統Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群未產生變化，抗炎因子IL-10未隨之改變。試驗組中，CPB中低溫、非生理性灌注等因素導致機體內環境變化，機體免疫系統、免疫細胞與CPB管道等各種變應原充分接觸，誘導特異性免疫系統Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群產生變化，向Th2、Tc2方向偏移，抗炎因子IL-10上調，介導機體抗炎反應上調。雖然手術創傷也活化非特異性免疫系統，導致炎性介質IL-6上升，但由于主導致炎反應的Th1、Tc1細胞減少以及介導抗炎反應的IL-10的抑制效應，表達水平明顯低于對照組。

其他研究結果顯示：CPB致細胞免疫功能下降、IL-10 等抗炎因子水平升高［8，11］，結合對炎癥介質觀察結果［12，13］可看出，CPB 對機體非特異性、特異性免疫系統均有影響。這種變化是機體對CPB的一種防御性反應，有助于機體平安渡過手術期。在一些因素作用下，如果對Th1、Tc1/Th2、Tc2細胞亞群的影響超出防御反應范圍，則可能演變成為致病因素：Th2、Tc2細胞介導的免疫應答過度，會引起細胞免疫功能抑制，削弱機體防御能力，易繼發病原微生物感染，甚至引發敗血癥、多臟器功能不全、多臟器功能衰竭等一些嚴重并發癥；Th1、Tcl細胞介導的免疫應答過度，可能引發全身非特異性炎性反應（SIRS），導致各種非感染性并發癥，亦可損害器官功能，導致嚴重并發癥。可以推測，Th1、Tc1/Th2、Tc2淋巴細胞功能亞群的失衡可能與CPB術后并發癥的發生有關。

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