重癥肌無力患者外周血中Th9細胞表達及其臨床意義

朱子云

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種以骨骼肌疲勞、波動性無力以及晨輕暮重現(xiàn)象為臨床特征的自身免疫性神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙疾?。?］。本病臨床嚴重患者通常因為累及呼吸相關(guān)肌肉群進而危及生命。據(jù)報道，MG的年發(fā)病率約為5.3/100萬，且呈現(xiàn)逐年增長勢頭［2］。但至今其具體詳細的發(fā)病機制尚不清楚，自身抗體如乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）抗體破壞 AchR 誘發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙是目前研究認可的MG發(fā)病原因，而自身抗體的過度分泌與免疫系統(tǒng)平衡紊亂密切相關(guān)［3］。 輔助性 T 細胞（T helper，Th）對 B 細胞分化分泌抗體的過程尤為關(guān)鍵。輔助性T細胞主要分為 Th1、Th2、Th9、Th17 和 Treg 細胞，其中 Th1、Th2、Th17和Treg等T細胞亞群與MG的發(fā)病關(guān)系已經(jīng)得以揭示，而輔助性T細胞亞群Th9是新近發(fā)現(xiàn)的一類CD4+Th細胞亞類，主要分泌IL-9效應細胞因子，已有大量研究證實其在多種炎性疾病中發(fā)揮重要作用，但其是否也在MG患者中存在異常，目前尚不清楚［4］。據(jù)此，該研究擬通過檢測MG患者外周血Th9細胞頻率及血清IL-9濃度，探討其在MG發(fā)病中的作用。

1　資料與方法

1.1對象及分組 選取2014年1月—2017年6月于九江市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診且被明確診斷的MG患者31例為MG組，其中男17例，女14例；年齡平均（43.51±16.92）歲。 診斷確診標準［5］：在具有MG典型臨床特征的基礎(chǔ)上，具備藥理學特征和（或）神經(jīng)電生理學特征，臨床上則可診斷為MG。有條件的單位可檢測患者血清AChR抗體等，有助于進一步明確診斷。排除標準：排除發(fā)病前3個月內(nèi)使用激素或免疫抑制藥患者，排除伴有腫瘤、感染及其他自身免疫性疾病患者。同時選取同期該院體檢中心30例健康體檢者作為對照組，其中男15例，女 15 例；年齡平均（42.79±16.53）歲。MG 組和對照組在年齡、性別構(gòu)成比等一般資料間均無統(tǒng)計學差異，具有可比性（P＞0.05）。

1.2血液標本采集 采集MG和健康對照者清晨空腹靜脈學6 ml，其中3 ml收集至干燥管用于血清IL-9濃度、anti-AchR濃度的檢測；另3 ml放置于EDTA抗凝管中，2 h內(nèi)完成外周血Th9細胞頻率的流式細胞術(shù)檢測。

1.3流式細胞術(shù)檢測Th9細胞頻率 采用貝克曼FC-500流式細胞儀檢測外周血Th9細胞頻率。其中所需要的抗人CD3、CD4和抗人IL-9抗體均購自ebioscience公司。檢測步驟如下：（1）RPMI 1640調(diào)整PBMC濃度至2.0×106/ml，接種于6孔板中加入25 ng/ml佛波酯、500 ng/ml離子霉素及1.7 μg/ml莫能霉素，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h；（2）加入抗 CD3和CD4抗體各10 μl，充分混勻，避光孵育15 min；（3）磷酸鹽緩沖液對混合細胞洗滌2次后離心去上清；（4）固定劑固定15 min，磷酸鹽緩沖液洗1次后離心去上清；（5）加入破膜劑室溫孵育5 min后離心去上清；（6）加入抗 IL-9 抗體 10 μl，避光孵育15 min；（7） 離心去上清后加入500 μl PBS懸浮后上機檢測。目的細胞Th9免疫表型為CD3+CD4+IL-9+。所得數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件獲取。

1.4血清IL-9、Anti-AchR水平測定 酶聯(lián)免疫法用于血清IL-9水平的測定，所需試劑盒購自ebioscience公司 （IL-9 Human ELISA Kit， 批號：BMS2081TEN），所有操作步驟按照說明書步驟和條件展開。此外，血清Anti-AchR濃度采用人anti-AChR放免試劑盒檢測，購自英國RSR公司（Human Anti-AChR ELISA Kit，批號：HZ-EL-H0347c）。

1.5統(tǒng)計學處理 利用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差形式表示，其中組間差異比較采用兩樣本t檢驗；組間相關(guān)性分析利用Spearman分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1兩組外周血Th9細胞頻率、血清IL-9及anti-AchR濃度比較 流式細胞術(shù)測定結(jié)果表明MG患者外周血Th9細胞頻率顯著高于健康人群所組成的對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。此外，血清IL-9水平和anti-AchR的濃度均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。見表1。

表1　Th9細胞比例和血清IL-9濃度變化

2.2MG患者Th9細胞頻率、IL-9濃度及anti-AchR濃度間相關(guān)性分析 利用Spearman分析各指標間相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，MG患者外周血Th9細胞比例與血清IL-9濃度呈顯著正相關(guān)性 （r=3.921，p＜0.05），與血清anti-AchR濃度間亦存在顯著正相關(guān)關(guān)系 （r=2.199，p＜0.05）。 同時， 血清 IL-9濃度與anti-AchR濃度之間的相關(guān)性也具有統(tǒng)計學意義（r=2.286，p＜0.05）。

3　討論

時至今日MG的發(fā)病機制仍不清楚，過度的自身抗體分泌使得其被歸為自身免疫性疾病，近年來隨著免疫學研究的不斷深入，MG病因?qū)W過程被證實涉及多種免疫細胞和細胞因子，免疫系統(tǒng)平衡的破壞被認為是MG發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］。然而，詳盡的機制并未得以闡明。Th細胞可輔助B細胞分化成可分泌抗體的B細胞，且自身可分泌一系列炎癥因子和抑炎因子，同時參與自身免疫性疾病的發(fā)病過程［7］。 目前研究已經(jīng)明確Th細胞可分為 Th1、Th2、Th9、Th17以及Treg細胞等亞類，且其在胸腺發(fā)育和成熟。而臨床研究證實約80%的MG患者通常合并胸腺異常，諸如胸腺增生和胸腺瘤。胸腺微環(huán)境的變化可能參與了MG的發(fā)生［8］。據(jù)此推測在胸腺分化發(fā)育的Th細胞或與常伴隨胸腺異常的MG存在一定的關(guān)聯(lián)。既往研究已經(jīng)證實Th1、Th2、Th17以及Treg細胞在MG患者及小鼠模型中存在異常，而新型輔助性細胞亞群Th9在MG中的作用尚不明了。IL-9可維持并促進CD4+T細胞、肥大細胞和Th17及Treg細胞的存活，這是其發(fā)揮生物學作用最重要的功能。Th9通過發(fā)揮自分泌和旁分泌作用，促進T細胞增殖并增強其他類Th細胞亞群的活化和細胞因子的產(chǎn)生。Th9和IL-9可作用于多種細胞，故參與疾病的機制亦有所不同。

該研究通過流式細胞術(shù)檢測MG患者外周血Th9細胞頻率的變化及血清IL-9濃度，并與健康對照人群進行比較，發(fā)現(xiàn)Th9細胞頻率和血清IL-9濃度在MG患者中均顯著高于對照組，差異顯著。這與崔冉等［9］在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類似，其中Th9表達的百分率與RA患者的DAS28、紅細胞沉降率、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)正相關(guān)。此外，Ouyang等［10］在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中亦發(fā)現(xiàn)Th9和IL-9存在顯著高表達。以上結(jié)果提示Th9參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程，其中包括MG。此外，Spearman分析發(fā)現(xiàn)MG患者外周血Th9細胞比例與血清IL-9濃度呈顯著正相關(guān)，血清IL-9則與anti-AchR濃度間也存在顯著正相關(guān)。這與先前Yao等［11］在GM實驗大鼠模型中已經(jīng)注射IL-9可減緩GM相關(guān)臨床癥狀，且血清anti-AchR濃度下降等研究結(jié)果相符。此外，在橋本甲狀腺炎患者中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果也與該研究類似，即外周血Th9細胞比例、血清IL-9濃度均比健康人群顯著上調(diào)，且與相關(guān)抗體滴度相關(guān)［12］。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)MG患者外周血存在Th9細胞和血清IL-9水平的異常變化，推測其可能參與了MG的發(fā)病過程，具體分子機制有待進一步研究。

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