miR-27a-3p對膀胱癌細胞EJ和5637生長的影響及其分子機制

毛萬里,趙　英,王　彬,張好春,王　斌,胡攀攀

(1重慶市永川區人民醫院急診科,重慶　402160;2重慶市永川區人民醫院檢驗科;3重慶鋼鐵集團總醫院神經外科;4重慶市永川區人民醫院泌尿外科;5重慶市大坪醫院腫瘤中心;*通訊作者,E-mail:cqycmjx@sina.com)

膀胱癌約占癌癥相關死亡的3%,是男性癌癥相關死亡的第九大常見原因[1]。盡管針對膀胱癌的治療有手術治療、放射治療和化療等多種療法,但膀胱癌的5年生存率仍較低[2]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,miRNA表達異常與多種腫瘤的發生發展相關[3]。miRNA為靶點的基因治療日益成為膀胱癌治療研究的重點[4]。miR-27a-3p是近年來研究發現的具有抑制肝癌、鼻咽癌、骨肉瘤等多種腫瘤生物學行為的小分子RNA[5-7],但其在膀胱癌細胞中的作用尚不明了。本研究觀察過表達miR-27a-3p對膀胱癌細胞生長的影響,探討其可能的分子機制,為以miR-27a-3p為靶點的基因治療提供實驗和理論基礎。

1　材料與方法

1.1　細胞株及主要試劑

膀胱癌細胞株EJ和5637購于中國典型培養物保藏中心;miR-27a-3p mimics、miR-NC購于廣州市銳博生物科技有限公司;RPMI-1640培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司;lipofectamine 2000、細胞周期試劑盒購于美國Invitrogen公司;噻唑藍(MTT)試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司;一抗KRAS、p-Raf-1、p-MEK、p-ERK和β-Actin均購于美國BD公司。

1.2　細胞培養及轉染

用含10% FBS的RPMI-1640培養基培養膀胱癌細胞EJ和5637,培養條件為37 ℃、5%CO2飽和濕度,取對數生長期細胞進行后續實驗。實驗分為兩組:miR-NC組(轉染miR-NC)和miR-27a-3p組(轉染miR-27a-3p),根據lipofectamine 3000說明書進行轉染。

1.3　MTT檢測細胞增殖活性

將轉染后24 h的EJ和5637細胞按3 000個/孔接種于96孔板,每組設3個復孔。分別于第1,2,3,4,5天,使用MTT試劑盒檢測細胞增殖活性。具體操作如下:在檢測前每孔先加入20 μl 5 g/L的MTT溶液,培養箱中繼續培養4 h,吸去培養液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,振蕩15 min,酶標儀讀取各孔在490 nm波長處所對應的吸光度A值。

1.4　集落形成實驗檢測細胞增殖能力

轉染后24 h,消化收集EJ和5637細胞,按1 000個/孔接種于6孔板。連續培養10 d,甲醇10 min,0.5%的結晶紫溶液染色30 min,清水緩慢吸去多余染液,晾干后每孔取4個視野計數集落數取平均值,實驗重復4次。

1.5　流式細胞術檢測細胞周期分布

轉染后48 h,消化收集EJ和5637細胞,使用細胞周期試劑盒檢測細胞周期分布。具體操作如下:預冷的PBS溶液洗3次,離心后用預冷的70%乙醇溶液重懸細胞,4 ℃固定3 h,PBS溶液洗3次,加入100 mg/L RNase A在37 ℃水浴30 min,加入含50 mg/L碘化丙啶溶液的PBS溶液500 μl,4 ℃避光孵育30 min,流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.6　miR-27a-3p靶基因預測

參考文獻[8]及使用miRNA靶基因預測網站TargetScanHuman 6.2(http://www.targetscan.org/vert-61/)預測miR-27a-3p的靶基因為KRAS,miR-27a-3p與KRAS序列互補結合區域見圖1。

圖1TargetScanHuman 6.2基因預測網站預測miR-27a-3p靶基因
Figure 1TargetScanHuman 6.2 gene prediction website predicts miR-27a-3p target gene

1.7　qRT-PCR檢測KRAS mRNA表達

提取轉染后48 h細胞總RNA,并逆轉錄為cDNA,以GAPDH為內參,使用熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR檢測,PCR擴增條件為:95 ℃ 60 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環。最終Ct值均以2-ΔΔCt分析。GAPDH引物序列:上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。KRAS引物序列:上游5′-ACAGAGAGTGGAGGATGCTTT-3′,下游5′-TTTCACACAGCCAGGAGTCTT-3′。

1.8　Western blot檢測KRAS蛋白及下游靶蛋白表達

收集轉染后48 h EJ和5637細胞,提取細胞總蛋白,每組分別取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰氨凝膠電泳,轉至NC膜,脫脂牛奶封閉,一抗、二抗孵育,滴加顯影劑顯影。

1.9　統計學分析

2　結果

2.1　過表達miR-27a-3p對膀胱癌細胞增殖能力的影響

MTT法檢測細胞增殖能力結果顯示,在第5天,miR-NC組和miR-27a-3p組EJ細胞的吸光度A值分別為1.53±0.13和1.00±0.09(t=3.32,P=0.03),5637細胞的吸光度A值分別為1.42±0.09和0.93±0.09(t=3.999,P=0.016),轉染miR-27a-3p組的膀胱癌細胞吸光度明顯低于miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2)。該結果顯示,過表達miR-27a-3p的EJ和5637細胞的增殖能力受到明顯抑制。

與miR-NC比較,*P<0.05圖2　MTT法檢測miR-27a-3p對膀胱癌細胞增殖能力的影響Figure 2　Effect of miR-27a-3p on the proliferation of bladder cancer cells by MTT assay

2.2　過表達miR-27a-3p對膀胱癌細胞集落形成能力的影響

集落形成實驗顯示,miR-NC組和miR-27a-3p組EJ細胞形成的集落數分別為159.20±16.83和53.56±10.92(t=5.267,P=0.002),5637細胞形成的集落數分別為194.90±11.52和114.10±18.88(t=3.653,P=0.011)。與miR-NC組相比,過表達miR-27a-3p的膀胱癌細胞形成的集落數顯著減少(P<0.05,見圖3),提示過表達miR-27a-3p后膀胱癌細胞增殖能力被抑制。

2.3　過表達miR-27a-3p對膀胱癌細胞周期分布的影響

流式細胞術顯示,miR-27a-3p組中G0/G1期細胞比例明顯高于miR-NC組(P<0.01),S期和G2/M期細胞比例明顯低于對照組(P<0.05,見表1,圖4),表明miR-27a-3p可顯著抑制膀胱癌細胞周期的進展。

細胞　分組　G0/G1　　S　G2/MEJmiR?NC4004±3243330±3992667±085miR?27a?3p6329±798??2404±360?1267±466??5637miR?NC4924±5792634±3902442±220miR?27a?3p6843±721??1802±289?1356±510??

與miR-NC比較,*P<0.05,**P<0.01

圖3　miR-27a-3p對膀胱癌細胞集落形成能力的影響Figure 3　Effect of miR-27a-3p on colony forming ability of bladder cancer cells

圖4　miR-27a-3p對膀胱癌細胞周期的影響Figure 4　Effect of miR-27a-3p on cell cycle of bladder cancer cells

2.4　過表達miR-27a-3p對膀胱癌細胞中KRAS mRNA表達的影響

qRT-PCR結果顯示,miR-NC組和miR-27a-3p組EJ細胞中KRAS mRNA相對表達量分別為1.02±0.11和0.32±0.09(t=4.812,P=0.003),5637細胞中KRAS mRNA相對表達量分別為1.00±0.03和0.18±0.02(t=24.160,P<0.001)。miR-27a-3p中KRAS mRNA相對表達量明顯低于miR-NC組(P<0.01,見圖5),表明miR-27a-3p具有抑制KRAS mRNA表達的作用。

2.5　過表達miR-27a-3p對膀胱癌細胞KRAS蛋白及下游蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與miR-NC組相比,miR-27a-3p組中KRAS及下游蛋白p-Raf-1、p-MEK、p-ERK的表達明顯降低(見圖6),表明miR-27a-3p具有抑制KRAS蛋白及下游蛋白表達的作用。

與miR-NC比較,**P<0.01圖5　qRT-PCR檢測KRAS mRNA表達情況Figure 5　KRAS mRNA expression in bladder cancer cells after miR-27a-3p overexpression by qRT-PCR

圖6　Western blot檢測KRAS及下游蛋白表達情況Figure 6　Expression of KRAS and downstream proteins in bladder cancer cells after miR-27a-3p overexpression by Western blot

3　討論

miRNA是一類內源性的非編碼RNA,通過特異性結合于基因mRNA的3′UTR區域發揮干擾基因表達的作用[4,9]。miR-27a-3p參與多種疾病包括腫瘤的發生、發展。miR-27a-3p可通過干擾SFRP1基因的表達調控Wnt/beta-catenin信號通路,抑制神經膠質瘤細胞的生物學行為[10]。miR-27a-3p能抑制人成膠質細胞瘤中BTS2基因的表達,并顯著抑制其生長和遷移[11]。也有研究表明,miR-27a-3p促進腫瘤的生長,miR-27a-3p可通過抑制PPAR-γ基因的表達促進肝癌細胞的增殖[12]。miR-27a-3p也可促進靶基因的表達,如miR-27a-3p可導致宮頸癌中B4GALT3基因的表達增加,促進EMT過程的發生,提升宮頸癌細胞的轉移能力[3]。然而,miR-27a-3p在膀胱癌中的作用研究尚未明了。

本實驗證實,轉染miR-27a-3p后的膀胱癌細胞的增殖能力降低,細胞周期進展阻滯,提示過表達miR-27a-3p具有抑制膀胱癌細胞增殖的作用。本研究參考文獻[8]及miRNA-mRNA基因預測網站TargetScanHuman 6.2認為miR-27a-3p可能通過抑制KRAS發揮作用。膀胱癌的發生、發展受多種基因的調控,KRAS是被普遍認為的一種癌基因,與膀胱癌的增殖、分化、凋亡等生物學行為密切相關[13]。因而,通過阻斷KRAS基因的表達,可能會抑制膀胱癌細胞的生長。本研究證實,過表達miR-27a-3p可明顯抑制KRAS基因的表達。KRAS參與調控MAPK信號通路的傳導,MAPK信號通路與腫瘤的增殖、分化、凋亡和衰老等生物學行為密切相關,參與腫瘤的發生、發展,在多數腫瘤中均發現該信號通路的異常[14]。本研究結果表明,過表達miR-27a-3p下調KRAS基因的表達后,p-Raf-1、p-MEK、p-ERK蛋白的表達均明顯下調,表明MAPK信號通路的異常傳導被抑制。由此可知,miR-27a-3p抑制膀胱癌細胞的增殖可能是通過抑制KRAS基因的表達,進一步干擾MAPK信號通路的轉導實現。有研究表明,MAPK信號通路與腫瘤的轉移密切相關[15],miR-27a-3p是否可通過阻斷MAPK信號通路抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力是本研究下一步研究的重點。

綜上所述,本研究證實miR-27a-3p可明顯抑制膀胱癌細胞的增殖能力,其可能的分子機制為miR-27a-3p抑制KRAS蛋白的表達,進而阻斷MAPK信號通路的傳導，為未來miRNA靶向治療膀胱癌提供了有力的實驗基礎。

參考文獻：

[1]Sankin A, Narasimhulu D, John P,etal. The expanding repertoire of targets for immune checkpoint inhibition in bladder cancer: What lies beneath the tip of the iceberg, PD-L1[J].Urol Oncol,2017,pii:S1078-1439(17)30176-X.

[2]Pinto IG. Systemic therapy in bladder cancer[J]. Indian J Urol, 2017, 33(2):118-126.

[3]Sun Y, Yang X, Liu M,etal. B4GALT3 up-regulation by miR-27a contributes to the oncogenic activity in human cervical cancer cells[J]. Cancer Lett, 2016, 375(2):284-292.

[4]Mitash N, Tiwari S, Agnihotri S,etal. Bladder cancer: Micro RNAs as biomolecules for prognostication and surveillance[J]. Indian J Urol, 2017, 33(2):127-133.

[5]Zhao N, Sun H, Sun B,etal. miR-27a-3p suppresses tumor metastasis and VM by down-regulating VE-cadherin expression and inhibiting EMT: an essential role for Twist-1 in HCC[J]. Sci Rep, 2016, 6:23091.

[6]Li L, Luo Z. Dysregulated miR-27a-3p promotes nasopharyngeal carcinoma cell proliferation and migration by targeting Mapk10[J]. Oncol Rep, 2017, 37(5):2679-2687.

[7]Salah Z, Arafeh R, Maximov V,etal. miR-27a and miR-27a* contribute to metastatic properties of osteosarcoma cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(7):4920-4935.

[8]Zhu L, Wang Z, Fan Q,etal. microRNA-27a functions as a tumor suppressor in esophageal squamous cell carcinoma by targeting KRAS[J]. Oncol Rep, 2014, 31(1):280-286.

[9]Keklikoglou I, Hosaka K, Bender C,etal. MicroRNA-206 functions as a pleiotropic modulator of cell proliferation, invasion and lymphangiogenesis in pancreatic adenocarcinoma by targeting ANXA2 and KRAS genes[J]. Oncogene,2015,34(37):4867-4878.

[10]Wang K, Xie D, Xie J,etal. MiR-27a regulates Wnt/beta-catenin signaling through targeting SFRP1 in glioma[J]. Neuroreport, 2015, 26(12):695-702.

[11]Li WQ, Yu HY, Zhong NZ,etal. miR27a suppresses the clonogenic growth and migration of human glioblastoma multiforme cells by targeting BTG2[J]. Int J Oncol, 2015, 46(4):1601-1608.

[12]Li S, Li J, Fei BY,etal. MiR-27a promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation through suppression of its target gene peroxisome proliferator-activated receptor gamma[J]. Chin Med J (Engl), 2015, 128(7):941-947.

[13]Ouerhani S, Bougatef K, Soltani I,etal. The prevalence and prognostic significance of KRAS mutation in bladder cancer, chronic myeloid leukemia and colorectal cancer[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(6):4109-4114.

[14]Burotto M, Chiou VL, Lee JM,etal. The MAPK pathway across different malignancies: a new perspective[J]. Cancer, 2014, 120(22):3446-3456.

[15]Sun Y, Liu WZ, Liu T,etal. Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation, differentiation, migration, senescence and apoptosis[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2015, 35(6):600-604.