單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)調控機制的研究進展

林志忠,葉志云,林圣彩,林舒勇

(廈門大學生命科學學院,福建 廈門 361102)

三磷酸腺苷(ATP)是幾乎所有細胞和有機體中最重要的能量載體,ATP水解成二磷酸腺苷(ADP)所釋放出的能量直接用于絕大多數生命活動,當能量進一步缺乏時ADP可再轉變為單磷酸腺苷(AMP)以提供更多的能量;而當能量充足時,細胞又可將AMP和ADP 重新轉化成ATP從而將能量存儲起來．在正常情況下,大部分真核細胞中的ATP濃度始終維持在一個非常穩定的水平,因此細胞中必然存在一個可以感知ATP、ADP和AMP水平變化的機制．

AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)目前已被公認是有機體和細胞內感應能量水平并調節代謝穩態的最重要分子．早期的研究發現,向大鼠的肝臟勻漿中加入AMP或ADP,可以有效地抑制2種脂肪酸合成過程中的關鍵酶——3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxy-lase,ACC)的活力從而強烈地抑制肝臟的脂肪合成[1-3]．進一步的研究表明,這一抑制作用實際上是由AMP引起的,且依賴于某個未知蛋白激酶的催化反應[4]．為了找到這個未知的蛋白激酶,蘇格蘭鄧迪大學的Hardie實驗室對大鼠肝臟勻漿進行了分離和純化,并對能夠響應AMP抑制ACC的組分進行了近4年的細致分析,終于在1989年找到了一個由分子質量分別為63,38和35 ku的3個亞基組成的蛋白,并根據該蛋白能被AMP激活的特性將其命名為AMPK[5]．

后來的研究表明,當細胞內處于能量缺乏狀態時,AMPK被激活,進而直接導致了多條信號通路的抑制或激活并引起一系列的生理變化(圖1),包括：促進脂肪細胞中甘油三酯的水解[6]，促進肝臟對血液中脂肪酸的攝取和氧化[7]，抑制脂肪酸和膽固醇的合成以及甘油三酯的形成[8-9],促進肌肉中脂類氧化以及葡萄糖的攝取和分解[10-11]，抑制胰島β細胞分泌胰島素以及糖原的合成[12]，抑制蛋白質的合成并促進自噬作用[13-15]和酮體的生成[16]等．其中,抑制脂肪酸合成并促進其氧化被認為是AMPK最經典的功能,主要是通過磷酸化并抑制其底物ACC的活力實現的,而ACC又是脂肪酸合成的關鍵酶[10]．這些作用的結果是增加體內的產能代謝,減少體內的耗能代謝,穩定體內能量水平，維持能量穩態,從而保證細胞的正常生命活動．由此可見,AMPK是機體內最重要的能量穩態調節者,它的功能和人類的生存與健康密切相關．

圖1　AMPK參與調控的許多重要細胞生物學過程Fig.1 Multiple important cellular biological processes regulated by AMPK

1　AMPK的結構

AMPK是由α、β和γ 3個亞基構成的一個異源三聚體．α亞基的N 端是AMPK催化活性的核心區域,包含一個保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域(kinase domain,KD)、C端的β亞基相互作用結構域(β-subunit interacting domain,β-SID)和與C端緊鄰的自抑制結構域(autoinhibitory domain,AID),其中AID的作用是通過結合KD來抑制α亞基的激酶活性[17-18];β亞基包含一個中等碳水化合物的結合模塊(mid-molecule carbohydrate-binding module,CBM)和一段位于C末端的連接α和γ亞基的結合序列(α,γ subunit-binding sequence,SBS);γ亞基含有4個參與結合ATP、AMP等的胱硫醚β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)結構域．當AMP結合到γ亞基上的CBS結構域時會引起該亞基發生變構,隨后影響AID的構象,使α亞基上的蘇氨酸172(T172)位點暴露出來,導致該位點被AMPK的上游激酶磷酸化[18-22]；同時由于AMP的結合導致的構象變化還可阻止該位點的去磷酸化,從而使AMPK保持較高的激活水平．相反地,ATP的結合則能夠抑制這一過程[23-24]．

在哺乳動物細胞中,AMPK的α和β亞基各包含2種不同的亞型(α1、α2和β1、β2),γ亞基包含3種不同的亞型(γ1、γ2和γ3),這些亞型均由不同的基因編碼表達,它們可以組合成至少12種不同的AMPK三聚體[25-26]．研究發現這些亞型的表達具有組織特異性,γ2在人體的心肌細胞中高度表達,而γ3則集中表達于快速抽動的骨骼肌細胞中;此外,在不同物種之間這些亞型的表達差異很大,如γ2在人的心肌細胞中高表達,但在小鼠的心肌細胞中表達量卻很低,而在小鼠的腦組織和脂肪組織中又是高表達的[27-28]．因此,AMPK不同亞型之間的關聯性及其在不同物種、不同組織細胞中所發揮的功能還有待進一步的深入研究．

2　AMPK的調控機制

如上所述,AMPK的激活依賴于其T172位點的磷酸化,目前已發現2種主要的上游激酶，分別為肝臟激酶B1(liver kinase B1,LKB1)和鈣離子/鈣調蛋白依賴蛋白激酶β(Ca2+/calmodulin-activated protein kinase β,CaMKKβ)[29-32]．LKB1是一個腫瘤抑制因子,自身處于持續激活的狀態,當組織缺氧、缺血或運動導致細胞內能量缺乏時,細胞內AMP/ATP比值上升,AMP與AMPK結合時后者的構象發生改變,使得AMPK的T172位點暴露出來,從而使LKB1能夠對該位點進行磷酸化,并可使其活性上升100倍以上[29]；而CaMKKβ則需要在細胞內鈣離子濃度升高時才能被激活，并進而磷酸化AMPK[30，33]．另外,早期的研究表明ADP與AMPK結合亦可引發與AMP相同的效應[34-35];但是較新的一項研究證明,只有當AMP與AMPK結合后LKB1才對其T172位點進行磷酸化,而ADP的結合只參與了抑制該位點的去磷酸化[22]．然而,這些發現大都基于體外的生化實驗,AMPK在體內被激活的機制，以及AMP對AMPK磷酸化的具體作用長期以來一直不為人知．

2013年,本課題組率先揭開了AMPK在體內被激活的“路線圖”，發現體軸發育抑制因子(axis inhibitor,AXIN)是LKB1激活AMPK所必需的，其中AXIN是一個多功能的構架蛋白,參與調節許多信號通路,如Wnt、JNK和p53等,對細胞生長起重要的調控作用[36-40]．當細胞在饑餓狀態下,由于AMP結合至AMPK后增強了后者對AXIN的親和力,而AXIN自身與LKB1有很強的相互作用，所以此時的AXIN起到了一個橋梁的作用,將AMPK和其上游激酶LKB1連接在一起,三者形成一個復合體,促進了LKB1對AMPK的磷酸化激活,使得AMPK的活性升高[41](圖2)．以上研究成果完善了AMPK活性調控過程中的關鍵一環,揭示了AMP促進AMPK磷酸化的分子機制．

圖2　AXIN激活AMPK的機制[41]Fig.2 Mechanism of AMPK activation by AXIN[41]

引自參考文獻[42],經修改．圖3　v-ATPase-Ragulator復合體調控AMPK和mTORC1活化切換的機制Fig.3 Mechanism of switch between AMPK and mTORC1 activation regulated by v-ATPase-Ragulator complex

隨后,本課題組又通過酵母雙雜交的方式找到了和AXIN相互作用的溶酶體相關膜蛋白LAMTOR1,并且證明該蛋白也是能量缺乏情況下AMPK激活所必需的[42]．LAMTOR1是一個錨定在溶酶體膜表面的蛋白復合體Ragulator的重要成員,在缺乏LAMTOR1的小鼠或細胞中,饑餓信號不能引起AMPK的激活．在能量充足的情況下,Ragulator通過其自身的鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)激活鳥苷酸酶Rag,從而使哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)遷移到溶酶體上并被激活,這時合成代謝途徑開啟(圖3(a))；而在能量不足的情況下,溶酶體上的能量感知者空泡型ATP酶(vacuolar-type ATPase,v-ATPase)發生變構,通過與其相互作用的Ragulator復合體共同促進AXIN-LKB1遷移到溶酶體上并與Ragulator結合,最后在此激活AMPK，同時AXIN抑制了Ragulator的GEF活力,進一步促進 mTORC1的解離,從而關閉合成代謝途徑,開啟分解代謝途徑(圖3(b))．

綜上,本課題組發現細胞內由于葡萄糖缺乏所引起的AMPK激活是在溶酶體膜上進行的,并且揭示了該過程所涉及的蛋白質機器．這一發現不僅揭示了AMPK在體內生理狀態下被激活的方式與過程,也解析了細胞在營養物質缺乏的情況下調節合成代謝與分解代謝的切換機制．

此外,除了能量缺乏以外,AMPK還可以響應多種藥物的刺激而被激活[43]．根據作用機制的不同可以將這些藥物分為以下3大類:1) 線粒體復合體抑制劑，通過抑制呼吸鏈來提高細胞內AMP/ADP水平從而激活AMPK,常見的如二甲雙胍(metformin)[44]、黃連素[45]等;2) AMP類似物的前體化合物,如5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside,AICAR)[46]和近幾年被發現的一種膦酸類化合物5-(5-hydroxyl-isoxazol-3-yl)-furan-2-phosphonic acid[47],這些化合物可在細胞內轉變為AMP類似物,從而直接提高AMP水平使AMPK被激活;3)AMPK激活劑，可直接作用于AMPK使之構象發生變化并隨后被激活,包括最早發現的被命名為A769662的化合物[48]以及最近發現的991[49]和MT-63-78[50]．在上述這些藥物中,二甲雙胍是一個重要的代表性藥物,已被廣泛應用于治療Ⅱ型糖尿病,它能通過激活AMPK來緩解脂肪肝并降低并發癥風險[51]．

為了進一步探究Ragulator-AXIN在藥理情況下對AMPK激活過程的調控作用,本課題組對缺失了LAMTOR1的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)進行二甲雙胍處理,發現二甲雙胍不能在這些細胞中激活AMPK；同樣地,對于LAMTOR1肝臟特異性敲除的小鼠,二甲雙胍也不能在其肝臟中激活AMPK；進而在缺失了AXIN的細胞和小鼠肝臟中檢測了二甲雙胍對AMPK的激活作用,發現AXIN是二甲雙胍激活AMPK所必需的，且二甲雙胍激活AMPK也是通過溶酶體途徑進行的,并依賴于上述溶酶體上的v-ATPase-Ragulator感應復合體[52]．這一發現不僅解決了二甲雙胍如何激活AMPK的重要問題,還為人們了解二甲雙胍降低糖尿病人的腫瘤發生機制打開了窗口．

3　AMPK和葡萄糖感應

引自參考文獻[59],經修改．圖4　細胞感知葡萄糖水平的分子機制Fig.4 Molecular mechanism of glucose sensing in cell

葡萄糖是生物界最基本、最主要的供能物質,故其水平和機體的能量代謝狀態本身就具有緊密的聯系；此外,葡萄糖代謝的中間產物又是幾乎所有合成代謝途徑最重要的原材料來源．可見,感受葡萄糖的水平并隨時作出相應的響應是生物體維持代謝平衡的基本功能．AMPK能夠響應機體葡萄糖水平的變化,并在其水平下降的時候被激活,該機制在各種表達有AMPK的真核生物中高度保守,從酵母到哺乳動物中都已被發現[53],是進化上少有的經典表型．

饑餓、運動等生理過程都會導致整體或某個器官的葡萄糖水平變化．在葡萄糖水平下降時,激活的AMPK能夠通過一系列方式維持代謝平衡和機體的正常生理功能．例如：饑餓能夠引起血液和組織液中葡萄糖水平的下降,AMPK在此時被激活,進而促進肝臟等組織中脂肪酸的β-氧化,使之轉換為利用脂肪酸[7];與此同時,AMPK還能促進肝臟生成酮體,通過血液供給腦部等不能利用脂肪酸的器官,以滿足這些組織的能量需求．許多生物的生命活動有晝夜節律(circadian rhythms),這種周期性也引起了機體內葡萄糖水平的周期性變化[54]，而AMPK能夠響應這種變化并維持機體能量穩態[55]．近年來,人們利用AMPK和葡萄糖之間的密切聯系開發了許多藥物，來模擬葡萄糖缺失的情況以激活AMPK,如無法被代謝的葡萄糖類似物2-DG和5-TG等[56-57],這些藥物能夠通過阻斷葡萄糖代謝達到激活AMPK的目的,并已應用于某些腫瘤的前期實驗中[58]．

因此,葡萄糖水平的感應對于AMPK的激活至關重要,是打開代謝穩態維持機制之門的“鑰匙”．然而,AMPK如何感應機體的葡萄糖水平并被激活的機制長期以來并不清楚,甚至存在重大的誤區．由于AMP在AMPK激活過程中的重要而經典的地位,它一直以來被認為是AMPK唯一的激活信號；同時，傳統的理論把葡萄糖看作一種“能量信號”,它的下降將引起細胞內ATP水平的下降和AMP水平的上升,后者作為激活劑直接激活AMPK．但實際上,并沒有一種生理狀態能夠驗證以上理論．

本課題組在對AMPK激活機制的深入研究中發現,無論是在葡萄糖缺乏的細胞培養條件下,還是在饑餓的低血糖動物體內,都不能檢測到AMP水平的上升,但與此同時AMPK卻處在被激活的狀態,這說明葡萄糖水平的降低與“能量缺失”無關,即與AMP水平無關,而是通過一種新的信號和一條獨立于能量代謝的通路來調控AMPK的激活．

本課題組之前已經發現了一條響應葡萄糖缺失并激活AMPK的溶酶體途徑[42],揭示了內源AMPK的激活過程．在此基礎上,進一步研究AMPK感受和響應葡萄糖水平而被激活的機制,成功地鑒定出傳遞葡萄糖水平的“信使”——果糖1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate,FBP),同時找到了感應這一“信使”的“感受器”——參與糖酵解通路的醛縮酶(aldolase),依靠這一套完整的信號系統,葡萄糖水平就能夠作為一種具體的信號調節AMPK的激活乃至整個機體的代謝穩態[59]．具體地說,當葡萄糖水平下降時,葡萄糖代謝物FBP的水平也相應地下降,該過程進一步被醛縮酶所感應,后者將啟動激活AMPK的溶酶體途徑進而介導AMPK的激活(圖4)．

這一發現改變了人們一直以來認為的AMPK活性只被代表低能量的AMP調節的觀點,是對傳統AMPK激活機制的一次重新認識；并據此提出,葡萄糖水平是機體的一種“狀態信號”,通過調節AMPK的激活從而調節機體代謝的總平衡．這對全面了解細胞代謝穩態維持的分子機制、糖代謝和相關應激反應乃至生理、病理進程有重要意義,且有助于為研發治療人類重大疾病的藥物提供全新、有效的靶點．

4　AMPK和疾病

糖尿病是一種糖脂代謝穩態失調、紊亂的疾?。延醒芯堪l現,在肥胖小鼠和Ⅱ型糖尿病病人的外周組織中,AMPK的活性明顯被抑制[60-61]．而AMPK的激活能夠促進肌肉中的葡萄糖轉運蛋白GLUT4轉移到細胞膜上[62-63],增加肌肉對血液中葡萄糖的吸收和分解代謝,從而降低血糖[64]．在肝臟中,當ATP缺乏引起AMPK的激活后，AMPK可以通過磷酸化轉錄輔激活因子CRTC2(也稱TORC2)促進其出核,或者通過磷酸化去乙酰化酶HDAC4/5/7促進轉錄因子FOXO1出核,這兩種方式的結果都是抑制肝臟的糖異生途徑,從而降低血糖[65-67]．

除了代謝性疾病,許多腫瘤的發生和代謝紊亂也有著密切的聯系．腫瘤以及腫瘤微環境與正常組織相比的一個重要特征就是代謝過程的不同,而代謝紊亂進一步促進了腫瘤的發生和發展[68-69]．由于腫瘤組織的快速增殖消耗大量營養,腫瘤微環境是一個營養匱乏的環境,這將引起腫瘤組織中AMPK的激活[70]．在細胞水平上,已經有大量的研究表明AMPK的激活可以通過抑制mTORC1復合體而抑制腫瘤細胞的合成代謝,從而阻止其增殖[71]；還可以通過促進p53的活性引起腫瘤細胞的生長阻滯和凋亡,從而抑制腫瘤細胞的生長[72-74]．因此,在多種腫瘤組織,如黑色素瘤、乳腺癌、結腸癌和肺癌組織中,AMPK的表達或者活性被強烈抑制,進一步打破了這些組織中原有的合成代謝和分解代謝的平衡,加劇了腫瘤的發展[70,75-76]．腫瘤微環境對免疫細胞中AMPK的激活則反過來阻止了促炎癥免疫細胞的分化和發育以及相關免疫因子的釋放,使之處于休眠狀態不能被激活并發揮效應,從而抑制了免疫反應對腫瘤組織的識別和殺滅,導致腫瘤的生長更加不受控制[77]．

5　結語與展望

作為能量代謝調節的核心分子,AMPK一直是細胞代謝領域研究的重點．雖然近年來人們已經在該領域獲得了一系列的新發現,然而對AMPK精細的調控機制還需要更深層次的研究．目前已知AMPK的激活存在以下兩條截然不同的途徑:1) 依賴于AMP(AMP-dependent)的經典途徑;2) 不依賴于AMP(AMP-independent)而通過糖酵解通路中代謝酶aldolase的途徑．那么,進一步需要回答的重要問題就是細胞如何根據生理狀況對上述兩種途徑做出選擇．另外,本課題組的研究發現細胞中存在兩個激活AMPK的位置——溶酶體和細胞質．那么,在這兩個位置上激活的AMPK是否有不同的底物及其生理意義也是后續研究中有待解決的問題，這不僅能夠幫助人們更深刻地理解AMPK以及代謝穩態的調控機制,還有助于理解和操控相關的重要生理過程和病理過程,最終為戰勝威脅人類健康的重大疾病貢獻力量．

過去的十幾年來,人們也一直在研發以AMPK為靶點用于治療代謝性疾病的藥物,并已篩選出了一些潛在的AMPK激活劑,如國際制藥巨頭Pfizer公司篩選出的名為991的化合物．然而,這些激活劑雖然在體外實驗中可以有效地激活AMPK,但其面臨的真正挑戰是能否在動物體內以及人體內也發揮同樣的功能．隨著人們對AMPK激活機制的不斷深入研究與解析,或許在不久的將來有望見證以全新的作用機制激活AMPK的藥物問世．

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