高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)配制酒中9種合成著色劑

◎ 劉子雄，劉映鑠，鄭鴻濤

（中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東　中山　528437）

配制酒是指以蒸餾酒、發(fā)酵酒或食用酒精為酒基，以食用動(dòng)植物、食品添加劑作為呈香、呈味、呈色物質(zhì)，按一定工藝加工而成，改變了其原酒基風(fēng)格的飲料酒。其生產(chǎn)工藝允許添加一定量的著色劑改善其色澤，而合成著色劑因性質(zhì)穩(wěn)定，染色效果好，成本低廉易得，用量少等特點(diǎn)受到不少食品企業(yè)的青睞。但是，過量攝入合成著色劑會(huì)對(duì)人體健康造成一定的危害。因此，GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]對(duì)允許添加的合成著色劑使用量作了相關(guān)規(guī)定。

目前，合成著色劑主流檢測(cè)方法是高效液相色譜法，其中GB 5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》[2]涉及7種著色劑的檢測(cè)，SN/T 1743-2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè) 高效液相色譜法》[3]涉及4種著色劑的檢測(cè)，共包含9種合成著色劑，分別為檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、酸性紅（偶氮玉紅）和赤蘚紅。GB 5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》中赤蘚紅的前處理方法與其他著色劑的前處理方法又不同，并不是利用聚酰胺粉吸附原理而是利用液液萃取進(jìn)行處理，在日常檢測(cè)工作中，特別是大批量多項(xiàng)目合成著色劑檢測(cè)工作中，往往造成一個(gè)樣品多次前處理，分別檢測(cè)，給日常檢測(cè)工作帶來不便，不僅檢測(cè)時(shí)間大大延長，對(duì)檢測(cè)資源也造成一定的浪費(fèi)。以下根據(jù)GB 5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》、SN/T 1743-2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè) 高效液相色譜法》和GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[4]的要求，參考有關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，再結(jié)合日常檢測(cè)工作的經(jīng)驗(yàn)，利用聚酰胺粉吸附原理，對(duì)配制酒中合成著色劑進(jìn)行提取和凈化，使用高效液相色譜儀和二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)進(jìn)行9種合成著色劑的檢測(cè)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器和試劑

儀器：安捷倫1260高效液相色譜儀，G1315D 1260DAD檢測(cè)器；Milli-Q Integral 3 System純水系統(tǒng)；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檸檬黃（純度95.5%）、新紅（純度89.0%）、莧菜紅（純度92.8%）、胭脂紅（純度98.2%）、日落黃（純度90.5%）、誘惑紅（純度86.3%）、亮藍(lán)（純度92.3%）、酸性紅（純度93.5%）、赤蘚紅（純度91.0%），均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；色譜級(jí)甲醇（默克）和乙酸銨（阿拉丁）；分析純甲醇，甲酸，無水乙醇，氨水，檸檬酸；層析用聚酰胺粉100～200目；一級(jí)水；配制酒試樣，購自超市。

1.2　溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液按GB 5009.35-2016方法要求配制，固體純品型標(biāo)準(zhǔn)品需根據(jù)純度折算濃度。pH=5的甲醇-水（V∶V=6∶4）：量取分析純甲醇60 mL，純水40 mL，混勻，然后用甲酸調(diào)節(jié)pH到5。乙醇-氨水-水（V∶V∶V=7∶2∶1）：量取乙醇70 mL，氨水20 mL，純水10 mL，混勻。檸檬酸溶液：稱取20 g檸檬酸，加水溶解并稀釋至100 mL。pH=5的水：水中加檸檬酸溶液調(diào)pH到5。乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3　樣品前處理

稱取樣品10 g（精確至0.001 g）至200 mL燒杯中，加水約40 mL混勻，用pH=5的水調(diào)節(jié)pH至酸性，置于60 ℃電子恒溫水浴鍋中，加入約1 g聚酰胺粉，攪拌。靜置至上層水溶液呈無色透明時(shí)，趁熱將樣品溶液倒入G3垂融漏斗中抽濾，用pH=5的水洗滌3次，每次10 mL，然后用pH=5的甲醇-水洗滌3次，每次10 mL，棄洗滌液。換干凈的抽濾瓶，用乙醇-氨水-水解吸3～5次，每次10 mL，直至色素完全解吸，收集解吸液至200 mL燒杯中，置于80 ℃電熱恒溫水槽中濃縮至約2～3 mL，加水定容至10 mL，經(jīng)0.45μm PTFE微孔濾膜過濾，使用高效液相色譜儀分析。

1.4　色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipae Plus C18（4.6×250mm 5-Micron）。流動(dòng)相：色譜甲醇（A）和0.02 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫，見表1。流速：1.000 mL/min。柱溫箱溫度：35 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。DAD檢測(cè)波長：亮藍(lán)檢測(cè)波長為575 nm，其他為480 nm（波長變動(dòng)時(shí)間設(shè)置為0～8.20 min，480 nm；8.21～8.57 min，575 nm；8.58～10.05 min，480 nm）。

表1　梯度洗脫條件表

2　結(jié)果

2.1　方法的線性和檢出限

在設(shè)定的色譜條件下，9種合成著色劑色譜分離情況如圖1所示，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。在本實(shí)驗(yàn)條件下，按照信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，結(jié)果見表2。

圖1　混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

表2　9種合成著色劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限表

2.2　方法的準(zhǔn)確度

方法準(zhǔn)確度用樣品加標(biāo)回收率表示，對(duì)試樣進(jìn)行3個(gè)濃度水平加標(biāo)，每個(gè)水平進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3　9種合成著色劑加標(biāo)回收率表

2.3　方法的精密度

方法精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，自制含有9種著色劑的配制酒試樣，進(jìn)行7次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算精密度，結(jié)果見表4。

表4　9種合成著色劑的方法精密度表（n=7）

3　討論

3.1　波長的選擇

GB 5009.35-2016和SN/T 1743-2006方法均采用254 nm作為檢測(cè)波長，但是在實(shí)際檢測(cè)過程中，特別是基質(zhì)較復(fù)雜的樣品，容易造成干擾，出現(xiàn)假陽性，而且亮藍(lán)在254 nm處響應(yīng)也較低。亮藍(lán)波長選擇為575 nm，響應(yīng)明顯提高，其他著色劑波長選擇為480 nm，基質(zhì)干擾明顯降低。

3.2　淋洗液的選擇

GB 5009.35-2016和SN/T 1743-2006方法均選擇甲醇-甲酸（V∶V=6∶4）作為其中一種淋洗液。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于酸性過強(qiáng)，當(dāng)以甲醇-甲酸淋洗吸附有赤蘚紅的聚酰胺粉后，赤蘚紅被一并洗脫下來，回收率基本為零。故本方法對(duì)淋洗液進(jìn)行了優(yōu)化，把甲醇-甲酸更換成pH=5的甲醇-水，赤蘚紅的回收率顯著提高，滿足定量要求。

4　結(jié)語

通過線性、檢出限、準(zhǔn)確度及精密度等方法確認(rèn)，本方法符合檢驗(yàn)要求，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并且節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和資源，可用于配制酒中合成著色劑的定量檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 2760-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 5009.35-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[3]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB SN/T 1743-2006食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè)高效液相色譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[4]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[5]戚榮平，夢(mèng) 琪，桑 嫻，等.聚酰胺粉吸附-高效液相色譜法測(cè)定蜜餞中合成著色劑[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25（10）：1525-1527.

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