基于納米壓痕實驗的犬牙周膜彈性模量研究

傅肄芃 王耀駿 吳斌 黃輝祥 嚴斌

口腔正畸治療中，牙周膜的應力與應變是牙齒移動的始動因素［1－2］，許多關于正畸牙移動過程中骨改建的理論都是基于這一假說，即應力與應變可以控制成骨細胞與破骨細胞的分化和活性。而牙周膜彈性模量則能反映牙周組織加載后初始的應力與應變關系。因此，準確認識牙周膜的彈性模量可以分析牙周組織的應力與應變［3］，了解矯治器的作用機制及力學性能，并確定不同矯治系統對牙齒的施力與牙齒位移的關系，進而實現正畸牙的有效移動，合理分配正畸治療時間，完善矯治系統［4］。

目前，國內外學者對于牙周膜彈性模量的研究［5］在以下方面仍存在不足：一方面，由于牙周膜結構的復雜性以及實驗對材料和儀器的要求很高，所以實驗結果準確性較差。不同文獻報道的牙周膜彈性模量范圍為0.01～1 750 MPa［6］，研究結果的差異很大。另一方面，大部分研究都是將牙周膜作為各向同性的生物材料，忽視了牙周膜不同部位以及位于同一牙根軸向不同位置可能存在的性質差異［7］。

在正畸牙受力情況下，一側牙周膜受壓力壓縮，另一側受拉力拉伸［8］。對于牙周膜的拉伸實驗，國內外許多學者已進行了大量研究［9］，而對壓縮性能有關的研究較少，且集中于宏觀測試。近年來，納米壓痕技術開始用于各種工程材料以及軟硬組織［10－11］力學性能的研究，此技術通過類似于針尖樣的壓頭壓入樣品表面而產生的印記來計算樣品的各項力學參數，是一種檢測材料微小區域力學性能的有效實驗手段，其精度可達納米級別。此外，納米壓痕還具有定點測試、對樣品形狀要求不高、操作簡單等優點。在口腔醫學領域主要用于牙釉質［12］、牙本質［13］等硬組織力學性能的測量，或是對粘結劑［14］、烤瓷牙冠材料等口腔用材料性能的驗證，而對于生物軟組織的研究較少。所以，為了完善牙周膜受壓力情況下的生物力學性能研究，本研究應用納米壓痕技術定量測定沿牙長軸不同層面和同一層面牙根不同方位（舌側、頰側、近中、遠中）的動物牙周膜彈性模量，分析差異并探究影響牙周膜彈性模量的可能因素。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與儀器

健康比格犬4只［雌性，2歲齡，南京醫科大學倫審（2015）169號］，空氣針法處死后制取樣本。

切片石蠟（上海華靈康復機械廠）（熔點56～58℃）；迷你鋼鋸（SATA，10in），低速切割機（IsoMet，Buehler，500 r／s，USA）；納米壓痕儀（Micro Materials，TM600，UK）；照片處理軟件 IMAGE ACCESS（Version 5.30，IMAGIC-Imaging Solutions，Germany）；圖表制作軟件Origin（Version 9，origin-lab，USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本制作與處理 實驗動物處死后立即將下頜骨分離，去除肌肉、黏骨膜等軟組織，沿下頜兩側第一磨牙近中和遠中鄰牙間隙鋸斷，使之與頜骨分離，得到8個含完整磨牙、牙周膜與牙槽骨的骨塊。隨后用石蠟將其包埋，用低速切割機在生理鹽水滴注冷卻下沿垂直于牙長軸的方向平行切片（圖1），制成厚度為（2.0±0.3）mm的樣本，每顆磨牙取3個切片樣本，根據其在牙根中的位置不同分為根中、根尖、頸緣3組，共獲取24個樣本。

圖1 樣本切片部位示意圖（A）以及橫斷面切片樣本（B，×10）Fig 1 Schematic diagram of the longitudinal location of the sample（A）and photograph of a typical transverse section of the sample（B，×10）

使用記號筆對根中，根尖，頸緣3組每個樣本近遠中，頰舌側4個方位標記壓入點，以利于在納米壓痕儀配備的顯微鏡下尋找定位。試件制作完成后置于生理鹽水中于 －20℃［15］凍存。

1.2.2 納米壓痕實驗原理 通過測定已知各項力學參數的壓頭在樣品表面留下的印記而推測樣品力學參數的方法稱為壓痕技術。而納米壓痕技術又是傳統壓痕技術在測量微小樣品時的具體應用。納米壓痕儀主要由掃描控制系統、傳感系統以及壓頭3個部分組成。其中，壓頭是影響實驗結果的重要因素，平頭壓頭［16］（與樣本接觸面為平面）比較適合軟材料彈性模量的測試［17］。

一個完整的壓痕過程通常包括兩部分，即加載過程和卸載過程［18］。圖2是利用納米壓痕測試儀測得的材料典型的加載－卸載過程的載荷－壓痕深度關系曲線。

圖2 納米壓痕實驗壓頭壓入牙周膜加載示意圖（A）和移位曲線（B）F：Load；Fmax：Maximum load；h：Displacement；hmax：Maximum displacement；hR：Displacementafter unloading；S：Elastic contact stiffnessFig 2 Schematic diagram of nanoindentation test（A）and loaddisplacement curve（B）

為研究材料的粘彈性蠕變行為，通常加載過程和卸載過程的中間加入一個保載的過程，即在某一段時間內，保持壓頭的載荷不變，此時壓頭位移會繼續增加，如在載荷位移曲線上表現出一個平臺的階段，可認為材料發生了蠕變。由Oliver-Pharr［13］提出而又廣泛被采用的納米硬度理論，約化彈性模量E*（reduced modulus）可由下式獲得：

經過預處理后，缺陷已被清晰地呈現出來。為了識別出缺陷，需要對缺陷的特征進行提取，提取的特征量能否準確地描述缺陷，這對后續的識別具有關鍵作用。

其中，納米壓痕壓頭與被測物體的接觸面積Ac＝πr2，β是與壓頭形狀有關的常數。對于圓形壓頭，β＝1，則有：

Oliver和Pharr推導出卸載段曲線的載荷與壓痕深度公式：

其中，F為壓痕載荷，C和m為通過Origin軟件對載荷位移曲線進行擬合得到的擬合參數，h為壓痕深度，hR為殘余壓痕深度，由于卸載剛度S＝dF／dh，對公式3求導，可得到卸載剛度：

代入公式2，可得約化彈性模量E*。

1.2.3 實驗設計 比格犬牙周膜切片樣本以所在牙根不同層面（頸緣、根中、根尖）為依據分為3組，每組8個樣本。每個樣本均有近中、遠中、舌側、頰側4個方位。在顯微鏡下找到牙周膜區域壓入點，牙周膜與牙體組織、骨組織在鏡下有明顯差別（圖3）。

圖3 納米壓痕儀顯微鏡下犬牙槽骨、牙周膜、牙骨質組織圖（×100）Fig 3 Micrographs of alveolar bone，PDL and cementum （×100）

顯微鏡下每個方位定義2×2的矩陣點，每個點均使用平頭壓頭以0.1 mN／s向牙周膜內壓入，直到應力到達1 mN后維持20 s保載時間，牙周膜得到充分的形變。然后以0.1 mN／s應力減少速率進行卸載，直至壓頭離開牙周膜表面。每個壓入點重復加載5次，繪制納米壓痕的載荷－位移曲線，并根據公式計算牙周膜的彈性模量。以圖4示例，取卸載初期斜率。

1.3 統計學方法

使用統計分析軟件 SPSS（Version 19.0，IBM，USA）對數據進行統計分析，評價牙根層面因素以及牙周膜方位因素對牙周膜彈性模量的影響，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖4 犬牙周膜樣本納米壓痕實驗載荷－位移曲線圖Fig 4 Load-displacement curve of beagle＇s PDL from nanoindentation test

2 結 果

對于24個樣本的納米壓痕實驗數據，分別計算彈性模量并按照所處牙周膜不同區域進行統計分析（表1）。

實驗結果顯示，比格犬牙周膜彈性模量最小值位于牙根頸緣樣本的頰側部位，為（0.452±0.118）MPa，最大值位于根中樣本的近中方位，為（1.542±0.591）MPa。表2析因設計方差分析顯示，牙根同一層面不同方位這一變異來源對牙周膜彈性模量具有顯著性影響（P＜0.05），而牙根層面和兩者交互作用因素對牙周膜彈性模量影響不顯著。進一步兩兩比較可知（表3），頰舌側與近遠中方位的牙周膜彈性模量具有顯著性差異，但頰側與舌側、近中與遠中沒有顯著性差異。

表1 納米壓痕實驗獲得的不同區域牙周膜彈性模量表 （±s，MPa）Tab 1 Elasticmodulus of various locations（x±s，MPa）

表1 納米壓痕實驗獲得的不同區域牙周膜彈性模量表 （±s，MPa）Tab 1 Elasticmodulus of various locations（x±s，MPa）

牙根層面牙根方位舌側 頰側 近中 遠中根中 0.716±0.380 0.600±0.366 1.542±0.591 1.190±0.254根尖 0.663±0.135 0.973±0.845 0.967±0.718 1.011±0.781頸緣 0.477±0.269 0.452±0.118 1.163±0.640 1.143±0.506

3 討 論

在生物力學研究領域，納米壓痕實驗方法多用于硬質材料的力學研究［19］，對于軟質地材料，尤其是生物軟組織材料研究較少。近年來，有學者［20］提出了采用納米壓痕儀研究牙周膜彈性模量的方法，本研究在該方法礎上進行了具體的實驗驗證。以往納米壓痕實驗中應用最多的是Berkovich壓頭，為一圓錐形壓頭，會對軟組織材料產生破壞性；故本研究采用了圓柱形平面壓頭，該壓頭能與被測表面充分接觸，并可減少尺寸效應帶來的測量誤差，較適用于軟組織材料的測試［17，21］。實驗中，對每壓入點使用平頭壓頭以 0.1 mN／s向牙周膜內壓入，直到應力到達 1 mN［21］，該大小的應力不會對牙周纖維產生破壞。從圖4可以看出，在保載過程中壓痕深度仍在增加，這說明牙周膜發生了蠕變［22］，體現了其粘彈性特征。由于蠕變這一現象的存在，較小的卸載率可能會導致卸載曲線的斜率出現負值，出現無法計算彈性模量的情況，可通過設置較大的卸載率或者增加保載時間減少蠕變對于實驗的影響。

表2 納米壓痕實驗的牙周膜彈性模量牙根層面、方位方差分析Tab 2 Variance analysis of different locations（circumferential and longitudinal）

表3 牙根方位間兩兩比較方差分析（LSD）Tab 3 Least significant difference（LSD）of PDL locations

目前部分學者認為牙周膜彈性模量約為1 MPa［23－24］，本研究通過納米壓痕實驗法測得的犬彈性模量介于（0.452±0.118）MPa與（1.542±0.591）MPa之間，與之相近。由于實驗中選取了牙根不同層面、不同方位的壓入點，不同壓入點之間的彈性模量存在差異。由于目前較為缺少類似的牙周膜微觀實驗數據支持，該部分內容的精確性和結論的可靠性需要后續實驗進行驗證。

本研究將實驗對象按沿牙長軸方向對不同層面分成頸緣、根中、根尖3組，由兩兩比較可知，牙根軸向層面因素對牙周膜彈性模量的影響不具備統計學意義。同時，對每個層面的樣本選取近中、遠中、舌側、頰側四個方位進行納米壓痕實驗，統計學分析顯示，牙周膜方位因素顯著影響了牙周膜彈性模量。關于牙周膜彈性模量的單軸拉伸實驗［25］也得出類似結論，即牙周膜方位因素對于牙周膜彈性模量的影響大于牙根層面因素，但由于納米壓痕實驗獲得的彈性模量只代表牙周膜在實驗位點處的微觀表征，而單軸拉伸實驗所獲得的彈性模量可以認為是無數個微觀位點彈性模量的總體表征，并且具體計算方法和遵循的理論依據也都不同。此外，本實驗研究結果顯示，頰舌側方位與近遠中方位牙周膜彈性模量具有顯著性差異。這與國外學者Uhlir等［26］對牛下頜中切牙橫斷面切片做軸向拉伸實驗，得到實驗組頰舌側與近遠中部分牙周膜彈性模量有顯著差異的結論相符。推測可能與牙周膜的彈性模量與牙周膜纖維密度、纖維分布、方向以及牙周膜厚度等因素有關。實驗中，頰舌向彈性模量小于近遠中，可能由于在比格犬后牙的咀嚼側向運動中，頰舌側所受的力大于近遠中，其較小的彈性模量支持了頰舌側牙周膜在受到較大應力的情況下，產生較小的應變，即相同應變下，可較近遠中承載更大的應力。而頰側與舌側、近中與遠中牙周膜彈性模量比較結果顯示沒有顯著性差異。此結果對于臨床上正畸牙不同方向移動時施加力的大小選擇，以及牙拔除時施力大小和方式可能有一定的指導意義，但還需要進一步的臨床研究來推理驗證。

本實驗測量位點多，當某些位點的載荷－位移曲線有明顯異常時可以摒棄并及時補測，從而有效減少實驗誤差。但是實驗中仍存在不足之處：本實驗的研究對象是實驗動物比格犬的牙周膜，比格犬牙周膜的組成與人牙周膜相似，但牙根形態、牙周膜厚度等與人牙齒有所不同，所以其生物力學性質與人牙周膜應當有所不同；且本實驗僅研究了比格犬磨牙的牙周膜，對于不同牙位牙周膜彈性模量的差異以及牙周膜在體內環境的生物力學性質等都有待今后進一步的研究。

4 結 論

本研究在微觀力學角度對比格犬磨牙牙周膜彈性模量進行了初步研究，得出了以下結論：①基于納米壓痕法測得比格犬牙周膜彈性模量約為0.452～1.542 MPa；②比格犬下頜磨牙沿牙長軸不同牙根層面的牙周膜彈性模量沒有明顯差異；③比格犬下頜磨牙沿牙長軸同一層面不同方位的牙周膜彈性模量存在明顯差異。

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