牙齦卟啉單胞菌菌毛質粒構建和蛋白純化

陳江曼 李永剛 李新

牙周病是一種牙周組織慢性感染的炎癥性疾病，由革蘭氏陰性厭氧菌引起，其可導致牙齒支持組織的破壞。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）被認為是牙周病發生和疾病進展中的主要病原體［1］，可釋放多種致病毒力因子［2］，其中菌毛（Fimbriae，FimA）在粘附到宿主細胞，促進細菌的入侵和感染中發揮著關鍵作用［3］。本研究擬通過基因克隆及重組技術構建P.gingivalisFimA可原核表達質粒，純化FimA融合蛋白，為臨床進一步研究P.gingivalis，制備牙周病亞單位疫苗提供部分實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

標準株P.gingivalisATCC33277（由中國醫科大學饋贈）；載體 PGEX-6P-1、（E.coil）DH5α感受態細胞、限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ、LA Tap酶及PMD19-T載體（TaKaRa公司，日本）；細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒DNA小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Axygen公司，美國）；蛋白親和層析GST-SefinoseTMKit（上海生工生物工程有限公司）；異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）等（北京索來寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙齦卟啉單胞菌培養及基因組提取 將－80℃凍存的P.gingivalisATCC33277菌株在室溫解凍，接種于改良的腦心浸出液肉湯（BHI）固體培養基（加入1 mg／L維生素K，1 g／L酵母提取物及5mg／L氯化血紅素）平皿中，37℃厭氧條件下培養4 d，在無菌超凈臺中刮取表面菌落，接種于BHI液體培養基中，約24 h待細菌長至對數期，離心棄上清收集菌體，采用細菌基因組 DNA提取試劑盒提取P.gingivalis基因組DNA。

1.2.2 PCR擴增目的基因 根據GenBank提供的P.gingivalisATCC 33277 FimA序列，運用 Premier 5.0軟件設計引物，上游引物 F：5′-3′ATTAGGATCCATGGTGGTATTGAAGACCAGC，下 游 引 物 R：5′-3′ATATCTCGAGCCAAGTAGCATTCTGACCAACGAG。采用LA Tap酶進行FimA基因擴增，反應條件為：94℃變性5 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃2 min，共25個循環，72℃延伸5 min，逐漸降至4℃。PCR產物由瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PGEX-6P-FimA可原核表達質粒的構建及鑒定 凝膠電泳分析，擴增的PCR產物與FimA片段大小一致，切取目的條帶回收純化。將純化的PCR產物與PMD19-T載體連接過夜，取10μl體系加入200μl DH5α感受態細胞中，冰浴30 min，42℃熱擊1 min，再冰浴2 min，加入400μl無抗生素的LB培養基，37℃輕搖60 min，取適量混合液涂于含氨芐青霉素（Ampicilin）的LB固體培養基平皿中，37℃過夜。次日，挑取單個白色菌落，接種于5 ml LB液體培養基中，37℃搖至對數期，離心棄上清小量提取質粒DNA并命名為PMD19-T-FimA。XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至公司測序。分別用XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切測序正確的PMD19-T-FimA質粒和空載體PGEX-6P-1質粒，回收目的片段。按照片段：載體＝7∶3（質量比）對酶切產物進行連接，將體系與DH5α感受態細胞混勻，按上述方法轉化并小量提取質粒DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗，將重組質粒命名為PGEX-6P-FimA。

1.2.4 FimA融合蛋白表達條件 挑取PGEX-6P-FimA單個白色菌落接種于30 ml含Ampicilin的LB培養基中，37℃ 180 r／min震蕩，待菌液A值在0.6～0.8之間，分別設置不同 IPTG誘導濃度（0、0.1、0.3、0.5、0.7、1 mmol／L），不同誘導時間（4、6、8、12、16 h），在不同溫度下（16、20、25、30、37℃）收集2 ml菌液，4℃8 000 r／min離心10 min，棄上清。用200 μl磷酸緩沖鹽溶液（PBS）充分重懸菌體，冰浴超聲破碎，直至清亮，4℃離心10 min，分別收集上清及沉淀，經SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色檢測最適誘導條件。

1.2.5 FimA融合蛋白大量表達及純化 通過上述實驗結果對比，在16℃，IPTG濃度為1 mmol／L條件下，誘導600 ml A600為0.74的菌液12 h，4℃離心棄上清，用20 ml PBS重懸菌體，按1∶100的比例加入200 μl苯甲基磺酰氟（PMSF），冰浴超聲直至清亮，4℃8 000 r／min離心30 min，棄上清，用 20 ml GuMCAC-0（20 mmol／L Na3PO3·12H2O，0.5 mmol／L NaCl，6 mmol／L鹽酸胍，pH7.9）充分溶解，4℃過夜。次日，4℃4 000 r／min離心30 min，收集油性上清加入至超濾離心管中，4℃4 000 r／min離心，并逐漸用不含咪唑的 MCAC-0緩沖液（20 mmol／L Na3PO3·12H2O，0.5 mmol／L NaCl，pH7.9）置換，待液體清亮后，將液體加入到GST凝膠層析柱中，控制流速緩慢過柱，抽提／平衡緩沖液（140 mmol／L NaCl，10 mmol／L Na2HPO4，1.8 mmol／L K2HPO4，pH7.5）流洗凝膠，直至無蛋白流出。最后用5～10倍凝膠體積的洗脫緩沖液（50 mmol／L Tris-HCl，33 mmol／L Glutathione，pH8.0）進行洗脫并收集液體，－80℃保存。

1.2.6 FimA融合蛋白鑒定 取少量洗脫液制樣行SDS-PAGE電泳，切取凝膠15 V，20 min半干轉至聚偏二氟乙烯膜（PDVF膜），于室溫用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST緩沖液稍加浸洗后將膜放入1∶2 500稀釋的GST抗體中，搖床4℃過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體為二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色液檢測。

2 結 果

2.1 PCR擴增FimA基因

小量提取的細菌 DAN濃度為0.125μg／μl，A260nm／A280nm＝1.85，說明DAN純度較好，無RNA酶污染。用提取的DNA為模板，LA Tap酶擴增目的基因，電泳顯示在1 000 bp處有一特異性條帶與FimA大?。? 044 bp）一致（圖 1）。

圖1 LA Tap酶擴增FimA基因Fig 1 LA Taq enzyme amplified FimA gene

2.2 重組質粒構建

將PMD19-T-FimA質粒和空載體PGEX-6P-1進行XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切，回收目的片段并連接，雙酶切驗證。電泳顯示有和預期大小一致的酶切片段，證明質粒構建成功，命名為PGEX-6P-FimA（圖2～4）。

2.3 FimA融合蛋白誘導表達

將重組質粒PGEX-6P-FimA在大腸桿菌中少量表達，經過不同誘導條件，超聲裂解各菌體，收集上清及沉淀，SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍檢測各條件下是否釋放蛋白及蛋白存在形式。結果顯示，在16℃，IPTG濃度為1 mmol／L，誘導12 h時蛋白量最多，且主要以包涵體形式存在（圖5）。

圖2 XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切PMD19-T-FimA質粒Fig 2 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PMD19-T-FimA

圖3 XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切載體PGEX-6P-1質粒Fig 3 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PGEX-6P-1

圖4 XhoⅠ／Bam4HⅠ雙酶切PGEX-6P-FimA質粒Fig 4 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PGEX-6P-FimA

2.4 FimA融合蛋白純化及鑒定

在最適條件下大量誘導FimA融合蛋白，通過對包涵體變性和梯度復性，4℃條件下與谷胱甘肽－瓊脂糖介質結合，經過流洗雜蛋白、洗脫等步驟，收集純化的FimA融合蛋白進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色。如圖6得到了純度較好的FimA融合蛋白，在約60 000處有一明顯特異性條帶，與融合蛋白大小預期相符（圖7）。

圖5 最適誘導條件Fig 5 Optimum inducing condition

圖6 洗脫蛋白Fig 6 Elution protein

3 討 論

口腔內特有的環境利于細菌的生長和繁殖，細菌的存在易刺激牙菌斑的形成，牙菌斑長期累積在硬組織和軟組織上則形成牙結石。雖然細菌的定居與侵入區域受到牙菌斑細菌和宿主先天防御機制之間的共同控制［4］，大多處于動態平衡，但是當菌塊延伸至齦下時可觸發免疫系統失衡［5］。目前，我國慢性牙周病發病率高達85%以上，是導致成年人牙齒喪失最主要的原因［6－8］，同時牙周病也可對其它全身疾病起到促進作用，甚至對個人生活質量及社會工作造成很大的影響［9－12］。

雖然臨床治療可以將受損的牙周組織恢復到原始形態，但其病變區域極易受到細菌的連續侵襲，可再次誘發牙周病的發生，因此應該針對疾病預防建立有效的牙周保健系統［13］。研究開發針對牙周病細菌的疫苗一直是牙周病治療的輔助方向之一。在動物牙周病實驗模型中，用滅活的P.gingivalis全細胞免疫發現可以減少該菌在齦下的數量并可減輕牙槽骨的吸收程度［14］，這提示疫苗可能成為預防和治療牙周病的有效措施。

本實驗旨通過目的基因克隆及構建可原核表達質粒，純化帶有GST標簽的FimA融合蛋白。GST標簽為谷胱甘肽巰基轉移酶標簽，其轉移酶可與底物特異性結合，同時GST標簽有高特異性，能較好的保留蛋白的抗原性和生物活性。在實驗過程中IPTG濃度、時間及溫度的變化都會影響融合蛋白的表達，本實驗經過多次誘導表達顯示，融合蛋白主要以包涵體形式存在，在16℃，IPTG濃度為1 mmol／L，誘導12 h時蛋白表達量最多，值得注意的是，GST標簽包涵體蛋白需要經過變性及梯度復性才能較好的與谷胱甘肽結合。經過SDS-PAGE和Western blot檢測，在約60 000 bp處顯示出特異性條帶，與預期蛋白大小相符。上述實驗結果顯示，本實驗純化出了特異性較高的FimA融合蛋白，為后續制備多克隆抗體，進一步研究FimA特性和在牙周病發生發展中的作用及臨床牙周病亞單位疫苗的研制提供了部分實驗基礎。

［1］Nagano Keiji.FimA fimbriae of the periodontal disease-associated bacteriumPorphyromonas gingivalis［J］.Yakugaku Zasshi，2013，133（9）：963－974.

［2］鄭恬恬，王小琴.慢性間歇性低氧條件下大鼠齦溝液中牙齦卟啉單胞菌的變化［J］.實用口腔醫學雜志，2017，33（5）：518－521.

［3］Liu Fen，Wang Yi，Xu Jing，etal.Effects of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on the expression of key genes involved in cholesterolmetabolism inmacrophages［J］.Arch Med Sci，2016，12（5）：959－967.

［4］Sotolongo J，Ruiz J，Fukata M.The role of innate immunity in the host defense against intestinal bacterial pathogens［J］.Curr Infect Dis Rep，2012，14（1）：15－23.

［5］Belkaid Y，Hand TW.Role of the microbiota in immunity and inflammation［J］.Cell，2014，157（1）：121－141.

［6］Schützhold S，Kocher T，Biffar R，et al.Changes in prevalence of periodontitis in two German population-based studies［J］.JClin Periodontol，2015，42（2）：121－130.

［7］Hasiuk P，Hasiuk N，Kindiy D，et al.Characteristics of cellular composition of periodontal pockets［J］.Interv Med Appl Sci，2016，8（4）：172－177.

［8］Aimetti M，Perotto S，Castiglione A，et al.Prevalence of periodontitis in an adult population from an urban area in North Italy：Findings from a cross-sectional populationbased epidemiological survey［J］.JClin Periodontol，2015，42（7）：622－631.

［9］Bansal M，Rastogi S，Vineeth NS.Influence of periodontal disease on systemic disease：Inversion of a paradigm：A review［J］.JMed Life，2013，6（2）：126－130.

［10］Han P，Sun D，Yang J.Interaction between periodontitis and liver diseases［J］.Biomed Rep，2016，5（3）：267－276.

［11］Tibúrcio-Machado CD，Bello MC，Maier J，etal.Influence of diabetes in the development of apical periodontitis：A critical literature review of human studies［J］.J Endod，2017，43（3）：370－376.

［12］Meusel DRDZ，Ramacciato JC，MottaRHL，et al.Impactof the severity of chronic periodontal diseaseon quality of life［J］.JOral Sci，2015，57（2）：87－94.

［13］Shin EA，Park YK，Lee KO，et al.Synthesis and assembly of Porphyromonas gingivalis fimbrial protein in potato tissues［J］.Mol Biotechnol，2009，43（2）：138－147.

［14］Cekici A，Kantarci A，Hasturk H，et al.Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease［J］.Periodontol 2000，2014，64（1）：57－80.