線粒體融合蛋白-1對牙周膜干細胞成骨分化能力的影響

翟啟明 李蓓 劉露 張青 金鈁

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，表現為牙周支持組織持續破壞，可導致牙齒喪失。然而目前的牙周治療手段并不能修復已喪失的牙周組織。牙周膜中存在一類具有自我分化能力的間充質干細胞——牙周膜干細胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）［1］。以往研究表明，牙周炎來源的PDLSCs在脫離微環境多次傳代后，仍表現出成骨分化能力下降［2－3］，因此明確炎癥PDLSCs成骨分化能力下降的調控機制是對于牙周組織再生修復具有重要意義。

線粒體作為細胞中重要的細胞器，參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程［4］。線粒體融合蛋白-1（Mitofusin-1，Mfn1）位于線粒體外膜上，參與調控線粒體融合分裂的動態過程［5］，同時能夠介導內質網－線粒體偶聯。研究表明，線粒體動態行為異常與線粒體形態調控、鈣信號調控、內質網應激等都有密切聯系［6］。然而，Mfn1在調控PDLSCs再生能力過程中發揮的作用尚未見報道。

本研究通過PCR檢測正常、炎癥來源、以及模擬炎癥微環境下PDLSCs中Mfn1的表達水平，并進一步通過在P-PDLSCs中轉染siMfn1下調P-PDLSCs中的Mfn1觀察其成骨分化能力改變，探討Mfn1在PDLSCs中對成骨分化能力的影響，為牙周病的治療提供理論基礎和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養基、L-谷胺酰胺、PBS緩沖液、1 000 U／ml青霉素、1 000 U／ml鏈霉素（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Amresco，美國）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技公司）；I型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松、茜素紅、TNF-α（Sigma，美國）；Trizol Regent（Life Technologies，美國）；siMfn1（Santa Cruz，美國）；cDNA反轉錄試劑盒及實時定量PCR試劑盒（Takara，日本）；體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡及照相系統、激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）；6孔板、平底96孔板（Falcon，美國）；二氧化碳恒溫培養箱、酶聯免疫檢測儀（Thermo，美國）；CFX96實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）；流式細胞儀（Beckman-Coulter，美國）。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs的分離培養 收集年齡20～40歲因正畸需要拔除的健康正畸牙、智齒及牙周炎患者的牙齒（健康及牙周炎來源牙齒各20顆），PBS沖洗后刮取牙周膜組織，I型膠原酶37℃消化1 h。等體積含10%胎牛血清的α-MEM終止消化，800 r／min離心5 min，棄上清液。α-MEM培養基／重懸后接種于6孔板，置于恒溫37℃、5%CO2孵箱中培養。待細胞爬出組織塊，獲取原代牙周膜干細胞。

1.2.2 PDLSCs的干細胞鑒定 取第1代H-PDLSCs與 P-PDSLCs，消化、離心、PBS清洗、重懸后，加入 1.5 ml EP管中，加入 2μl鼠抗人 CD29、CD90、CD45、CD34抗體，避光孵育1 h，PBS清洗，流式細胞儀檢測細胞表面標志物。

1.2.3 IL-1β體外模擬炎癥微環境 選取第4代的H-PDLSCs，傳代至6孔板，細胞匯合度達80%后，在H-PDLSCs中分別加入0、5μg／ml IL-1β培養，每2天換液1次。

1.2.4 siMfn1轉染細胞 轉染前將細胞接種至6孔板，待細胞匯合度達90%～95%時，轉染前2 h換無血清無雙抗培養液。以Lipo 6000為載體，實驗組轉入siMfn1，對照組僅加入Lipo 6000，6 h后終止轉染。24～48 h后提取RNA，檢測其干擾效率。

1.2.5 成骨誘導培養 接種細胞后，加入成骨誘導培養基誘導（地塞米松100 nmol／L，10%胎牛血清的α-MEM、維生素 C 50 mg／L、β甘油磷酸鈉 10 mmol／L）。成骨誘導第7天提取兩組RNA，實時定量PCR檢測RUNX2、ALP和OCN成骨相關基因表達。成骨誘導第28天進行茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶定量：60%異丙醇室溫固定5 min，ddH2O水化處理細胞2 min，染色1 min，ddH2O沖洗2次，大體及鏡下觀察礦化結節形成情況。照相后每孔加入氯化十六烷基吡啶，充分溶解，96孔板，每組6個復孔，酶聯免疫檢測儀檢測吸光值。

1.2.6 RT-PCR檢測方法檢測 Mfn1、ALP、RUNX2與OCN mRNA表達 將所需樣本去除培養基，PBS清洗2遍。用Trizol一步法抽提總RNA，RNA質檢合格后逆轉錄合成cDNA。PCR引物序列見表1。本研究所用引物皆由上海生工生物工程技術有限公司合成。以GAPDH為內參，檢測基因相對表達量。

1.3 統計學分析

用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析，采用兩獨立樣本t檢驗，結果以±s表示。雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 基因引物序列Tab 1 Primer sequences

2 結 果

2.1 PDLSCs間充質干細胞鑒定

流式細胞儀檢測結果表明，H-PDLSCs與 PPDLSCs中，間充質干細胞標記物CD29、CD90均呈強陽性表達，造血系統來源細胞表面標記物CD34、CD45均呈陰性表達，以上結果說明本次實驗所分離培養的PDLSCs為間充質干細胞（圖1）。

2.2 牙周炎來源的P-PDLSCs成骨分化能力下降

分別分離培養正常及炎癥來源牙周膜干細胞HPDLSCs與P-PDLSCs，經成骨誘導7 d后，P-PDSLCs中成骨相關基因ALP、RUNX2與OCN表達量較HPDLSCs低（圖2A）。成骨誘導28天后茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶結果顯示，P-PDLSCs的礦化結節形成能力低于H-PDLSCs（圖 2B、2C）。上述實驗驗證了牙周炎來源的PDLSCs成骨分化能力下降。

2.3 IL-1β模擬炎癥微環境下的PDLSCs成骨分化能力下降

與H-PDLSCs組相比，炎癥因子IL-1β模擬炎癥微環境下的 PDLSCs，成骨誘導 7 d后，其 ALP、RUNX2、OCN表達量下降（圖3A）。同時成骨誘導28 d后，其茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶結果顯示，其礦化結節形成能力下降（圖3B、3C）。上述實驗說明，在應用5μg／ml的IL-1β刺激7 d的情況下，可以引起PDLSCs成骨分化能力下降，這種趨勢與牙周炎患者體內分離出的P-PDLSCs的成骨分化能力下降表現一致。由此可知，炎癥微環境可導致PDLSCs成骨分化能力下降。

圖1 流式細胞儀檢測H-PDLSCs與P-PDLSCs細胞表面標記物的表達情況Fig 1 The examination ofmesenchymal stem cell phenotype by flow cytometric analysis

圖2 H-PDLSCs與P-PDLSCs成骨分化能力的比較Fig 2 The comparison of osteogenesis differentiation capability between H-PDLSCs and P-PDLSCs

圖3 IL-1β模擬體外炎癥微環境下PDLSCs成骨分化能力Fig 3 The osteogenesis differentiation capability of H-PDLSCs stimulated by IL-1β

2.4 炎癥微環境下PDLSCs中Mfn1表達升高

RT-PCR結果顯示，與正常來源的H-PDLSCs相比，牙周炎來源的P-PDLSCs中Mfn1基因表達量顯著升高（圖 4A）。同時，在H-PDLSCs＋IL1β組中，IL-1β模擬體外微環境下的Mfn1表達量也呈升高趨勢（圖4B）。

2.5 下調Mfn1基因促進PDLSCs成骨分化

小干擾RNA siMfn1能夠特異性下調Mfn1基因的表達。在P-PDSLCs中轉染SiMfn1后，基因水平檢測M fn1下調效果，RT-PCR結果表明轉染有效（圖5A）。

圖4 Mfn1在3組細胞中的表達Fig 4 MORF level in the 3 groups

在P-PDLSCs中下調Mfn1后進行成骨誘導。成骨誘導7 d，RT-PCR結果顯示成骨基因ALP、RUNX2、OCN表達量升高（圖5B）；成骨誘導28 d，茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶結果顯示，P-PDLSCs＋SiMfn1組較P-PDLSCs組礦化結節形成能力增加（圖5C、5D）。

圖5 下調Mfn1表達對P-PDLSCs成骨分化能力的影響Fig 5 The evaluation of osteogenesis differentiation capability of P-PDLSCs following down-regulation of Mfn1

3 討 論

越來越多的研究表明，線粒體功能異常與眾多疾病的發生發展密切相關。線粒體作為細胞的“能量工廠”，是細胞中能量的主要來源，參與多種物質代謝和鈣穩態的調控，同時對于細胞的增殖、凋亡具有重要意義［7］。不同于其他細胞器，線粒體擁有其自身的遺傳體系和遺傳物質，是具有自我復制能力的半自主細胞器。線粒體具有雙層膜結構，它并不靜止的存在于細胞中，而是處于不斷融合與分裂的動態運動中［8］，由此產生了細胞中大小、長短、形態不一的線粒體。線粒體可以通過這種高度運動的狀態，使不良線粒體可以通過相互融合的方式得以修復，也可以通過分裂進而啟動線粒體自噬，使細胞內質量較差的線粒體得以清除［9－10］。有研究表明，線粒體動態異常與帕金森疾病、心肌梗死、動脈粥樣硬化等疾病具有重要相關性［11－12］。課題組前期研究發現，炎癥微環境中PDLSCs出現內質網應激［13］，而細胞中的內質網與線粒體存在線粒體融合蛋白介導的結構偶聯［14］。另有研究發現，侵襲性牙周炎與部分線粒體基因缺失突變有關［15］。然而，在炎癥微環境下，PDLSCs中線粒體融合蛋白是否發生改變，以及其是否能進一步影響PDLSCs的成骨分化尚不清楚。

線粒體融合蛋白-1（mitofusin 1，Mfn1）位于線粒體外膜，是一種GTP酶蛋白，當其被GTP水解酶，可以促進線粒體外膜的快速融合［8］。此外，線粒體外膜上的Mfn1還能夠與內質網膜上的Mfn2相互連接，搭建起內質網與線粒體間的“物理橋梁”［14］。研究表明，當Mfn1發生突變后，會引起線粒體融合功能的降低，進一步引起細胞功能的紊亂［16－17］。IL-1β是一種致炎因子，在給予PDLSCs脂多糖刺激后，可檢測到IL-1β的分泌［18］，同時可以激活多個炎癥相關通路［19］，因此本實驗采用IL-1β模擬炎癥微環境。本研究的實驗結果表明，與正常來源PDLSCs相比，炎癥及IL-1β模擬炎癥微環境下的PDLSCs中Mfn1表達量升高，說明炎癥微環境影響Mfn1的表達。同時，本研究也驗證了炎癥來源及模擬炎癥微環境下的PDLSCs成骨分化能力下降，而下調P-PDLSCs中的Mfn1表達水平后，其成骨分化能力增強，表明Mfn1對于PDLSCs的成骨分化能力具有調控作用。

以上結果表明，在炎癥環境中，線粒體融合蛋白-1的表達發生改變，并可能由此影響了其介導的線粒體融合及內質網-線粒體偶聯，從而使線粒體發生功能紊亂、代謝異常或線粒體內遺傳物質的，而進一步導致PDLSCs成骨分化能力的下降。在臨床上，針對性的下調Mfn1表達水平，或使用Mfn1抑制藥物，可能會成為治療牙周炎的新靶點。然而，炎癥是如何影響Mfn1的表達，以及Mfn1表達改變后，會引起哪些體功能的變化從而導致了成骨分化能力的下降，這些機制仍需要深入研究和探討。

［1］Seo BM，Miura M，Gronthos S，etal.Investigation ofmultipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364（9429）：149－155.

［2］Liu N，Shi S，Deng M，et al.High levels ofβ-catenin signaling reduce osteogenic differentiation of stem cells in inflammatorymicroenvironments through inhibition of the noncanonicalWnt pathway［J］.J Bone Miner Res，2011，26（9）：2082－2095.

［3］Liu Y，Liu W，Hu C，et al.MiR-17 modulates osteogenic differentiation through a coherent feed-forward loop in mesenchymal stem cells isolated from periodontal ligaments of patientswith periodontitis［J］.Stem Cells，2011，29（11）：1804－1816.

［4］Kasahara A，Scorrano L.Mitochondria：From cell death executioners to regulators of cell differentiation［J］.Trends Cell Biol，2014，24（12）：761－770.

［5］Youle RJ，van der Bliek AM.Mitochondrial fission，fusion，and stress［J］.Science，2012，337（6098）：1062－1065.

［6］Son MJ，Kwon Y，Son MY，et al.Mitofusins deficiency elicitsmitochondrialmetabolic reprogramming to pluripotency［J］.Cell Death Differ，2015，22（12）：1957－1969.

［7］Luchsinger LL，de Almeida MJ，Corrigan DJ，et al.Mitofusin 2 maintains haematopoietic stem cells with extensive lymphoid potential［J］.Nature，2016，529（7587）：528－531.

［8］Otera H，Mihara K.Molecularmechanisms and physiologic functions ofmitochondrial dynamics［J］.JBiochem，2011，149（3）：241－251.

［9］Westrate LM，Drocco JA，Martin KR，et al.Mitochondrial morphological features are associated with fission and fusion events［J］.PLoSOne，2014，9（4）：e95265.

［10］Song M，Franco A，Fleischer JA，et al.Abrogating mitochondrial dynamics inmouse hearts acceleratesmitochondri-al senescence［J］.Cell Metab，2017，26（6）：872－883.

［11］Kasahara A，Cipolat S，Chen Y，etal.Mitochondrial fusion directs cardiomyocyte differentiation via calcineurin and Notch signaling［J］.Science，2013，342（6159）：734－737.

［12］Mei YQ，Pan ZF，Chen WT，et al.A flavonoid compound promotes neuronal differentiation of embryonic stem cells via PPAR-βmodulating mitochondrial energy metabolism［J］.PLoSOne，2016，11（6）：e0157747.

［13］Xue P，Li B，An Y，et al.Decreased MORF leads to prolonged endoplasmic reticulum stress in periodontitis-associated chronic inflammation［J］.Cell Death Differ，2016，23（11）：1862－1872.

［14］van Vliet AR，Verfaillie T，Agostinis P.New functions of mitochondria associated membranes in cellular signaling［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843（10）：2253－2262.

［15］郭園，王嘯軒，欒慶先.線粒體基因7.4kbp大片段缺失突變與侵襲性牙周炎的關系研究［J］.實用口腔醫學雜志，2014，30（1）：99－102.

［16］ForniMF，Peloggia J，Trudeau K，etal.Murinemesenchymal stem cell commitment to differentiation Is regulated by mitochondrial dynamics［J］.Stem Cells，2016，34（3）：743－755.

［17］Son JM，Sarsour EH，Kakkerla Balaraju A，et al.Mitofusin 1 and optic atrophy 1 shiftmetabolism tomitochondrial respiration during aging［J］.Aging Cell，2017，16（5）：1136－1145.

［18］Kong X，Liu Y，Ye R，et al.GSK3βis a checkpoint for TNF-α-mediated impaired osteogenic differentiation ofmesenchymal stem cells in inflammatorymicroenvironments［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1830（11）：5119－5129.

［19］Mao CY，Wang YG，Zhang X，et al.Double-edged-sword effect of IL-1βon the osteogenesis of periodontal ligament stem cells via crosstalk between the NF-κB，MAPK and BMP／Smad signaling pathways［J］.Cell Death Dis，2016，7：e2296.