長鏈非編碼RNA MALAT1在口腔鱗狀細胞癌患者血漿中的表達及意義

王軍 趙思語 歐陽少波 廖嵐

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，發病率占全身腫瘤的第九位，且近年來呈增高趨勢［1］。因其具有早期診斷難、易發生淋巴結轉移且預后差等特點，5年整體生存率僅為50%左右［2］。目前其診斷主要依靠臨床檢查和組織活檢，且因患者就診時往往已處于癌癥中晚期，影響療效。另外一些血漿腫瘤標志物的檢測，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖鏈抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9），對口腔鱗癌早期診斷的敏感性和特異性尚不明確［3］。因此，尋找敏感度高和特異性強的腫瘤標志物是近年來口腔鱗癌研究的熱點。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸、不具有蛋白質編碼功能的RNA［4］。近年研究表明，lncRNA的表達失調與腫瘤的復發、轉移及預后密切相關［5］。同時，研究發現lncRNA能夠穩定存在于外周血中，其檢測對于疾病診斷及判斷預后具有重要意義［6］。肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）是最早發現的 lncRNA之一，與多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移密切相關［7－8］。已有研究表明MALAT1在口腔鱗癌組織中異常表達，可能參與口腔鱗癌的發病過程［9－10］，然而尚未見有關其在口腔鱗癌血漿中表達的報道。本研究旨在檢測MALAT1在口腔鱗癌患者血漿中的表達水平，分析其與口腔鱗癌臨床病理特征之間的關系，并探討其在口腔鱗癌診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015-01～2017-01在南昌大學第二附屬醫院口腔頜面外科收治的口腔鱗癌患者70例，其中男42例，女28例，年齡37～73歲，中位年齡52歲。口腔鱗癌患者均為初次確診，術前均未進行過化療、放療、生物治療及中西醫結合治療，且無合并其他腫瘤、高血壓、糖尿病、感染性疾病及免疫系統疾病。鱗癌原發灶及頸淋巴結轉移灶均經由組織病理確診。詳細記錄腫瘤部位、大小、TNM分期、病理分級及淋巴結轉移等參數。并采集15例患者術后30 d靜脈血用于比較手術前、后血漿MALAT1變化。選取同期南昌大學第二附屬醫院健康體檢者作為對照組，共50例，男性28例，女22例，年齡34～75歲，中位年齡50歲。健康對照人群無口腔黏膜疾病，且無腫瘤、高血壓、糖尿病、感染性疾病及免疫系統疾病。口腔鱗癌組及健康對照組之間年齡、性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究已通過南昌大學第二附屬醫院倫理委員會的批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

實時熒光定量PCR儀（7500型 ABI，美國）；Trizol LS試劑（Invitrogen，美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和 SYBR?Premix Ex TaqTM（大連寶生物TaKaRa公司）；熒光定量PCR引物（上海生工生物工程技術有限公司）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集 清晨分別采集口腔鱗癌組和健康對照組外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，并盡快進行血漿分離，即4℃1 000 g，離心10 min，吸取上清液至EP管，－80℃凍存備用。

1.3.2 血漿總RNA的提取及cDNA合成 按Trizol LS試劑說明書提取血漿樣本總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。采用分光光度儀檢測總RNA濃度和質量。檢測合格后取1μl RNA，采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser逆轉錄獲得互補脫氧核糖核酸（cDNA）。

1.3.3 實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）反應 采用SYBR法進行RT-qPCR檢測，檢測步驟及反應條件參照試劑盒說明書進行。內參GAPDH上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物為 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；MALAT1上游引物為：5′-CTTAAGCGCAGCGCCATTTT-3′，下游引物為 5′-CCTC CAAACCCCAAGACCAA-3′。以20μl反應體系進行檢測。反應體系為：1×SYBR Green Imaster-mix、0.5 μmol／L特異前向引物、0.5μmol／L特異反向引物、1 μl反轉錄產物。反應條件為：95℃預變性 10 min后，95℃15 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，共40循環。所有樣品做3復孔。根據待測標本的Ct值，以GAPDH為內參，采用相對定量法對RT-qPCR結果進行分析，以2－△△Ct表示口腔鱗癌血漿目的基因的表達相對于對照組的變化倍數。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行分析。采用Kolmogorov-Smirnov（K-S）檢驗對數據進行正態分布檢驗，結果以±s表示，兩樣本均數比較用t檢驗，手術治療前后患者血漿MALAT1表達水平比較采用配對t檢驗，多組間的比較采用ANOVA方差分析。采用GraphPad Prism 5軟件，以敏感度為縱坐標，1-特異度為橫坐標繪制口腔鱗癌組和健康對照組相比較的受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC），并計算曲線下面積（area under of ROC curve，AUC）評估血漿MALAT1的診斷效能。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 口腔鱗癌患者與健康對照組血漿MALAT1表達水平的比較

采用RT-qPCR技術檢測受試者血漿中MALAT1的表達水平，結果顯示，口腔鱗癌患者血漿中的MALAT1的相對表達量（2.12±1.18）高于健康對照組（1.02±0.44）（t＝5.84，P＜0.001）。

2.2 口腔鱗癌患者血漿MALAT1的表達與臨床病理特征的關系

分析血漿MALAT1的表達與口腔鱗癌患者臨床病理特征（年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、腫瘤分化程度、有無淋巴轉移及TNM分期等）之間的關系。結果表明，血漿MALAT1的相對表達量與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關（P＜0.05）（表 1）。

表1 口腔鱗癌患者血漿MALAT1表達水平和臨床病理參數的相關性（±s）Tab 1 The relationship between the expression of plasma MALAT1 and its clinicopathologic features of OSCC（±s）

表1 口腔鱗癌患者血漿MALAT1表達水平和臨床病理參數的相關性（±s）Tab 1 The relationship between the expression of plasma MALAT1 and its clinicopathologic features of OSCC（±s）

臨床病理參數 n 血漿MALAT1的表達量 P值性別 男45 1.99±0.18 ＝0.610女25 2.16±0.23年齡（歲） ≤50 22 1.89±0.19 ＝0.445＞50 48 2.14±0.18腫瘤類型 舌癌 33 2.28±1.29 ＝0.142牙齦癌 18 1.49±0.50頰黏膜癌 10 2.13±1.02腭癌 5 2.26±1.99唇癌 4 2.31±1.23腫瘤大小 T1 17 2.08±0.93 ＝0.558 T2 31 1.91±1.30 T3 10 1.95±0.59 T4 12 2.48±1.54 TNM分期 Ⅰ＋Ⅱ期 47 1.74±0.89 ＝0.005Ⅲ ＋Ⅳ期 23 2.69±1.46腫瘤分化程度 中、高分化 56 1.88±0.92 ＝0.016低分化 14 2.75±1.80頸淋巴結轉移 無 53 1.76±0.88 ＝0.001有17 3.03±1.83

2.3 手術治療前后口腔鱗癌患者血漿MALAT1表達水平變化

對15例成功接受口腔鱗癌手術治療的患者手術前后血漿MALAT1水平進行監測，結果顯示，術后30 d血漿 MALAT1表達（1.16±0.56）與術前（2.68±1.35）相比顯著降低（P＜0.001）（圖 1）。

2.4 血漿MALAT1在口腔鱗癌患者中的診斷價值

采用ROC曲線評估血漿MALAT1作為口腔鱗癌生物標記物的診斷價值，結果顯示，血漿MALAT1診斷口腔鱗癌 ROC的 AUC為 0.814（95%CI：0.738－0.891；P＜0.001），具有較好的診斷效果，以 1.18為臨界值，血漿MALAT1鑒別口腔鱗癌和健康對照的敏感度和特異度分別為87.43%和72.00%（圖2）。

3 討 論

圖1 口腔鱗癌患者手術前后血漿中MALAT1表達水平Fig 1 Relative expression levels of plasma MALAT1 between preand post-operation samples

圖2 血漿MALAT1診斷口腔鱗癌的ROC曲線Fig 2 Receiver operating characteristic（ROC）curve analysis of plasma MALAT1 for the discriminative ability of OSCC patients vs healthy controls

口腔鱗癌是口腔頜面部最常見的的惡性腫瘤之一，包括吸煙在內的多種因素可以導致口腔鱗癌的發生發展，但其具體病因尚未明確［11］。盡管現在包括手術、放療和化療等在內的治療技術已經取得長足進步，但是由于口腔鱗癌患者早期常無明顯癥狀不易引起重視，造成確診時患者往往已處于腫瘤進展期或晚期，導致患者的5年生存率幾乎沒有提高［12］。早診斷早治療能夠大大提高口腔鱗癌患者的預后生存期，但由于口腔活組織病理學檢查具有有創性且操作復雜，并可能造成癌細胞的擴散，不適用于大量人群的篩查。因此，迫切需要探尋一種更加有效的腫瘤標記物用于口腔鱗癌的早期診斷。

越來越多的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾和核內運輸等多種重要的調控過程，在許多疾病的發生發展中具有重要的作用［13］。同時研究發現，lncRNA廣泛存在于外周血中，如血清、血漿等，且循環lncRNA可以穩定存在于循環系統中［14］。近年來，人們發現腫瘤患者體內循環lncRNA的表達與正常人存在差異，并隨著腫瘤的發展而具有特異性變化，是腫瘤診斷潛在的生物學標志物［15－16］。例如，Wang等［17］發現食管癌患者血清中HOTAIR表達顯著上調，ROC分析結果顯示HOTAIR診斷食管癌的曲線下面積為0.793。Zhou等［18］研究發現胃癌患者血漿中H19表達異常，對胃癌的診斷具有一定價值。已有研究報道了在口腔鱗癌病變組織中存在諸多異常表達的lncRNA，如HOTAIR［19］、UCA1［20］等。目前尚未見有關循環 lncRNA在口腔鱗癌中的研究報道。

MALAT1最早在非小細胞肺癌的研究中被發現，全長6 700 bp，位于染色體11q13.1，是lncRNA家族的重要成員之一。大量研究證實MALAT1可通過調節上皮間質轉化、發揮競爭性內源性信使RNA作用或參與表觀遺傳調控以及細胞周期調控［21］，促進腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲。其被發現在多種腫瘤中表達上調，如結腸癌、肝癌、乳腺癌等［22］。在口腔鱗癌研究中，Zhou等［9］發現在口腔鱗癌癌組織中MALAT1表達顯著上調，并且高表達的MALAT1可以通過誘導上皮間質轉化促進腫瘤的生長及轉移。本研究著重探討MALAT1在口腔鱗癌患者血漿中表達水平的變化及其是否可作為口腔鱗癌診斷的可靠生物標志物。

本研究通過RT-qPCR技術對70例口腔鱗癌患者及50例健康對照者血漿MALAT1的表達水平進行檢測，結果發現MALAT1在口腔鱗癌血漿中表達顯著上調，且MALAT1的相對表達量與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移顯著相關。15例接受口腔鱗癌手術治療的患者術后30 d血漿中MALAT1表達水平顯著降低，提示術后監測血漿 MALAT1表達水平或有助于監測口腔鱗癌的療效和預后。ROC曲線分析顯示血漿MALAT1診斷口腔鱗癌的ROC曲線下面積為0.814，提示其可作為診斷口腔鱗癌的的有效標識。

需要指出的是，由于本研究收集樣本的時間較短，未對口腔鱗癌患者長期隨訪以觀察疾病進展和生存預后情況，因此未能分析血漿中MALAT1的表達與患者生存率之間的相關性。在下一步研究中，將在擴大樣本量的同時對口腔鱗癌患者進行定期隨訪，以進一步分析血漿中 MALAT1的表達值在口腔鱗癌患者預后判斷中的意義。

綜上，本研究結果表明血漿MALAT1在口腔鱗癌患者中表達顯著上調，并且其表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移顯著相關，有望成為口腔鱗癌早期診斷及療效監測的潛在生物標記物。

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