環介導等溫擴增-無電加熱法檢測乳中阪崎克羅諾桿菌

付世騫，曲艷艷，馮曉涵，滿朝新，姜毓君

(東北農業大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)，原名阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)[1]，隸屬于腸桿菌科，氧化酶呈陰性，兼性厭氧，革蘭氏陰性，周生鞭毛可運動[2-3]。它是一種能夠引起新生兒腦膜炎、壞死性小腸結腸炎和敗血癥的條件性致病菌[4-5]，其主要污染來源為嬰兒配方粉，對嬰幼兒的致死率高達80%[6-7]。我國食品安全國家標準規定，阪崎克羅諾桿菌在嬰兒配方粉中不得檢出，這使得建立一種能夠快速有效的阪崎腸桿菌的檢測方法具有重大意義。

當前現有的檢測阪崎克羅諾桿菌的方法包括傳統微生物培養法、分子生物學檢測方法[8]。傳統的微生物培養法具有較長的檢測時間和復雜的檢測過程。分子生物學檢測方法靈敏度高、特異性強、檢測速度快，然而卻需要電、技術人員、冷藏等條件，因此使用受限[9]。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種新型的核酸恒溫擴增方法，它的特點是快速、簡單、靈敏度高、特異性強，并且在恒溫條件下就可以完成擴增反應，LAMP產物可通過肉眼觀察或瓊脂糖凝膠電泳法完成對檢測結果的判定[10-12]。基于LAMP的這些特點，特別適用于在資源環境有限的條件下完成對嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的現場檢測，但LAMP擴增需要熱源。

本研究利用氧化鈣和水反應放熱結合特定熔點的相變材料設計一種無電加熱器，它與環介導等溫擴增技術相結合，能夠滿足LAMP對時間和溫度的要求，最終通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴增結果[13-15]。本實驗所建立的檢測方法，靈敏度較高，檢測時間短，整個檢測過程中操作不需復雜的儀器且不需要電，沒有經過培訓的非專業人員也可以操作[16-17]，能夠應用在資源條件有限的環境中實現嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1菌株

本實驗使用菌株如表1所示。

1.1.2主要生化試劑

引物，英濰捷基(上海)貿易有限公司；甜菜堿，Sigma公司；瓊脂糖，美國Amresco公司；DL 2000 DNA marker，北京百泰克生物技術有限公司；Bst2.0 DNA Polymerase，New England Biolabs 公司；dNTP，寶生物工程(大連)有限公司；TSA瓊脂培養基，青島海博生物有限公司；氧化鈣，天津市致遠化學試劑有限公司；相變材料，杭州魯爾能源科技有限公司。

1.2　儀器與設備

Bcn136O型生物超凈工作臺，上海佳勝儀器制造有限公司；DYY-10C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；UVP凝膠成像系統，美國UVP公司；GL-21M高速冷凍離心機，上海市離心機機械研究廠；快速混勻器，姜堰市新康醫療器械有限公司；微量臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；高壓滅菌器，上海三申醫療器械有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；ZHWY200B型全溫度恒溫培養搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；保溫飯盒、溫度記錄器、K型熱偶線，超市購買。

表1　主要菌株及其來源和LAMP電泳結果Table 1　Main strains and sources and the electrophoresis results of LAMP

注：“+”為陽性結果；“-”為陰性結果。

1.3　方法

1.3.1菌株的活化與保藏

在20 mL NB培養基中以2%的接種量接種已純化的ATCC 29544菌液，于37 ℃、200 r/min的條件下培養8 h，使菌體處于對數生長期，用于后續菌體DNA的提取和菌種保藏。取培養8 h左右的阪崎克羅諾桿菌培養液250 μL加到750 μL含有80%甘油的凍存管中，混勻后密封。在-20 ℃冰箱中保存。

其他細菌培養方法與上述培養方法基本一致，所用的固體和液體培養基分別是NA和NB培養基，按照細菌的最適生長條件進行培養。

1.3.2細菌計數方法

利用經過滅菌的0.85%的生理鹽水進行稀釋，對阪崎克羅諾桿菌細菌培養液進行連續10倍梯度稀釋。然后分別取稀釋倍數為10-6、10-7、10-8的3個梯度進行平板涂布。將涂布好的平板放置在37 ℃下培養24 h，使其長出單菌落并進行計數。平板計數選取的菌落范圍在30～300之間，菌落平均數乘以稀釋倍數再乘10即為原菌液的活菌濃度(CFU/mL)。

1.3.3細菌DNA的提取

本研究采用試劑盒法快速提取細菌基因組DNA，于-20 ℃保存備用。

1.3.4引物的設計與合成

本研究選取了目的基因為阪崎腸桿菌ITS基因，對其設計引物用于環介導等溫擴增。運用引物在線設計軟件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)進行引物設計。最終設計出6條引物：外引物B3、F3，內引物FIP、BIP和環引物LF、LB。引物序列為：

F3-AAATGCGCGGTGTGTCAG;

B3-GGTTTCCCCATTCGGACAT;

FIP-ACCGTGTACGCTTGTTCGCTTTCTCTCAAACTCGCAG CAC;

BIP-GGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA;

LF-AACCTCACAACCCGAAGA;

LB-AGCGCCGGTAAGGTGATA

1.3.5無電加熱器

加熱器的結構如圖1。首先將一定量的氧化鈣放到市售的保溫飯盒內，添加一定量的水將其和氧化鈣攪拌均勻，將稱取好的相變材料放到小鋁盒內，再將小鋁盒放到氧化鈣和水的混合物中并被包埋。小鋁盒上帶有適合尺寸為200 μL PCR管的孔。將連有溫度記錄器的熱偶線插入到相變材料中測定其溫度。

a-無電加熱器的外觀圖;b-無電加熱器的切面圖圖1　無電加熱器的結構圖Fig.1　The structure of the electricity-free heater

1.3.6氧化鈣與水的比例的優化

針對65 ℃的相變材料，固定相變材料及氧化鈣的質量是10 g和30 g，水的添加量分別是4、5、6、7 mL。將連有溫度記錄器的熱偶插入到相變材料中測定其溫度。

1.3.7在無電加熱器中進行LAMP擴增的特異性研究

選取13株阪崎克羅諾桿菌和22株非阪崎克羅諾桿菌，提取基因組DNA作為模板并在無電加熱器中進行LAMP反應，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，用以驗證所設計引物的特異性，同時檢驗在無電加熱器中是否發生非特異性擴增。

1.3.8LAMP無電檢測體系的建立

配置25 μL的環介導等溫擴增反應體系，分別將優化到最佳配比的內引物、外引物、環引物、10×ThermoPol Buffer、MgSO4、脫氧核糖核苷酸(dNTPs) 、Bst2.0 DNA 聚合酶及DNA模板混勻，最后加入滅菌水至25 μL。整個恒溫反應為64 ℃持續45 min，然后于80 ℃保持5 min結束反應。利用無電加熱器和傳統的用電加熱器分別進行LAMP反應，最終利用2%的瓊脂糖凝膠電泳方法分別進行檢測。

1.3.9靈敏度的檢測

1.3.9.1阪崎克羅諾桿菌純培養物的靈敏度實驗

阪崎克羅諾桿菌三區劃線于TSA培養基，培養18～24 h后長出單菌落，挑取單菌落加入到NB培養基中，培養8 h后進行10倍梯度稀釋并涂布計數，確定其活菌的濃度。然后采用試劑盒法提取細菌基因組DNA，利用LAMP方法確定克羅諾桿菌純培養物的檢測限，其檢測結果通過瓊脂糖凝膠電泳法進行觀察。

1.3.9.2人工污染的嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的靈敏度實驗

在人工污染嬰兒配方奶粉前，利用國標的方法檢驗，確定不含阪崎克羅諾桿菌。將1 g嬰兒配方奶粉加入8 mL生理鹽水使其全部溶解，分別取1.3.9.1所述的1 mL進行梯度稀釋的菌液加入溶解的嬰兒配方奶粉中，并以不污染阪崎克羅諾桿菌的嬰兒配方奶粉作為陰性對照。采用試劑盒法提取DNA，并作為LAMP反應的模板。利用LAMP法確定污染阪崎克羅諾桿菌的嬰兒配方奶粉的檢測限，其中檢測結果通過瓊脂糖凝膠電泳法進行觀察。

1.3.9.3不同環境溫度下乳中阪崎克羅諾桿菌靈敏度的檢測

嬰兒配方奶粉的污染、DNA的提取和LAMP反應及結果的觀察如1.3.9.2所述，與其不同的是利用無電加熱器進行靈敏度的測定，分別在4、25和37 ℃的環境溫度條件下進行。

2　結果與分析

2.1　氧化鈣與水的比例優化

LAMP反應溫度為65 ℃左右，通過計算溫度的平均值和標準偏差得出相變材料的溫度譜線如圖2所示，藍色線代表相變材料的溫度，隨著氧化鈣和水的比例的降低，相變材料的溫度逐漸升高。如圖2-B所示，當氧化鈣和水的量分別為30 g和5 mL時，無電加熱器能滿足LAMP反應的溫度和時間。在進行LAMP反應的過程中，200 μL的離心管大約45 min后從加熱器中取出來。

2.2　在無電加熱器中進行LAMP擴增的特異性研究

在無電加熱器中進行LAMP擴增后，LAMP產物通過觀察瓊脂糖凝膠電泳電泳條帶得出檢測結果。結果如表1所示，所有13株阪崎克羅諾桿菌均顯示陽性，所有22株非阪崎克羅諾桿菌均顯示陰性，因此證明了LAMP引物的特異性，并且證明在無電加熱器中進行LAMP未發生非特異性擴增。

圖2　氧化鈣與水的比例的優化(65 ℃)Fig.2　Optimization of the proportion calcium oxide and water(65 ℃)(注：1. 固定相變材料及氧化鈣的質量為10 g和30 g；2. 水的添加量A-D分別為: 4、5、6、7 mL。)

2.3　LAMP無電檢測體系的建立

經過優化，最佳的LAMP體系見表2。

表2　LAMP的最優體系Table 2　The optimal LAMP reaction system

上述LAMP體系在65 ℃條件下反應45 min, 80 ℃條件下終止反應5 min。

利用無電加熱器和傳統用電加熱器分別進行LAMP反應，通過觀察電泳條帶得出檢測結果如圖3。結果表明，利用無電加熱器能夠完成LAMP反應的過程，與傳統的帶電加熱器沒有產生顯著性差異。

M-Marker;1-陰性;2-用電加熱器;3-無電加熱器。圖3　無電加熱器和傳統用電加熱器檢測結果的電泳圖Fig.3　The electrophoregram of detection in the portableelectricity-free heater and conventional electric heater

2.4　靈敏度的檢測

2.4.1阪崎克羅諾桿菌純培養物的靈敏度實驗

原始菌液濃度為2.6×109CFU/mL，進行梯度稀釋后泳道1～7的菌液濃度依次為2.6×105～2.6×10-1CFU/mL。從圖4可知，1～4泳道都有典型的LAMP擴增條帶，而5～7未見LAMP擴增。由此可見，利用無電加熱器和有電加熱器對阪崎克羅諾桿菌純培養物的檢測靈敏度均為2.6×102CFU/mL。

2.4.2人工污染的嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的靈敏度實驗

泳道1～7的菌液濃度依次為從4.2×105～4.2×10-1CFU/mL。從圖5可見，泳道1～4的LAMP反應都發生擴增，而5～7未見LAMP擴增，由此可知，利用傳統用電加熱器和無電加熱器檢測嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的靈敏度均為4.2×102CFU/mL。

M-DNA marker;1～7-分別對應菌液濃度為2.6×105、2.6×104、2.6×103、2.6×102、2.6×101、2.6×100、2.6×10-1 CFU/mL; 8-陰性對照圖4　阪崎克羅諾桿菌純培養物的靈敏度Fig.4　The detection sensitivity of C. sakazakii in the pure cultures

2.4.3環境溫度對檢測靈敏度的影響

在不同的環境溫度下，對嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度見表3，結果表明在4、25 ℃和37 ℃的環境條件下，其檢測靈敏度均能達到102CFU/mL，因此證明在操作環境溫度4～37 ℃的條件下，利用無電加熱器檢測嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的靈敏度是穩定的。

表3　不同環境溫度下檢測嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的靈敏度Table 3　The sensitivity of the C. sakazakiiin powderedinfant formula in different ambient temperature

3　結論

在核酸擴增技術中環介導等溫擴增法具有較高的靈敏度、特異性、簡單、快速、LAMP維持恒溫即可實現擴增等特點，與PCR方法相比，LAMP對一些抑制物不敏感[18]，制備較簡單，而且LAMP產物的檢測可以通過橫向流動試紙條[19]、添加染料和觀察濁度法等進行可視化檢測，特別適用于現場檢測。本實驗利用設計的無電加熱器維持LAMP反應所需要的溫度和時間，以實現核酸擴增的目的，整個過程操作簡單、不需要電和專業人員，在資源有限的環境即可實現檢測。

在無電加熱器中進行LAMP擴增的特異性檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳圖表明，所有13株阪崎克羅諾桿菌均顯示陽性，所有22株非阪崎克羅諾桿菌均顯示陰性，因此證明了LAMP引物的特異性，和在無電加熱器中進行LAMP未發生非特異性擴增。

阪崎克羅諾桿菌檢測靈敏度的測定分別利用無電加熱器和傳統的帶電加熱器加熱，結果表明，2種加熱方式對克羅諾桿菌的檢測靈敏度并沒有產生顯著性差異。在資源有限的環境條件下，例如野外、家庭及貧窮的地區等，在檢測的過程中可能會遭受低溫或者高溫，所以需要證明無電加熱器在整個檢測過程中所得出的檢測靈敏度是可靠的，不會因為環境溫度過高或者過低影響檢測靈敏度，我們針對4、25和37 ℃ 3個環境溫度，利用無電加熱器對嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌進行靈敏度穩定性的檢測。結果表明3個不同環境溫度對檢測靈敏度并沒有產生顯著性差異，檢測靈敏度均能達到102CFU/g。因此針對乳中克羅諾桿菌檢測設計的無電檢測體系在現場檢測是具有實用性的。

[1]趙貴明, 劉洋, 陳穎, 等. 克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數據庫的建立及應用[J]. 食品科學, 2014, 35(8): 105-110.

[2]梁安莉, 石云良, 孫貴娟, 等. 克羅諾桿菌致病性研究進展及流行現狀[J]. 中國熱帶醫學, 2016, 16(10): 1 045-1 048.

[3]KALYANTANDA G, SHUMYAK L, ARCHIBALD L K.Cronobacterspecies contamination of powdered infant formula and the implications for neonatal health[J]. Frontiers in Pediatrics, 2015(3): 56.

[4]周文琦, 王蕊, 王喆, 等. 乳中阪崎克羅諾桿菌的快速捕獲方法的建立[J]. 中國乳品工業, 2016, 44(12): 19-21.

[5]董鑫悅, 滿朝新, 盧雁, 等. 環介導等溫擴增法快速檢測乳中阪崎腸桿菌[J]. 食品工業科技, 2013, 34(5): 318-320.

[6]SONBOL H, JOSEPH S, MCAULEY C M, et al. Multilocus sequence typing ofCronobacterspp. from powdered infant formula and milk powder production factories[J]. International Dairy Journal, 2013, 30(1):1-7.

[7]SONG X, SHUKLA S, Lee G, et al. Detection ofCronobactergenus in powdered infant formula by Enzyme-linked Immunosorbent Assay using anti-Cronobacterantibody[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7(e52091).

[8]李春梅, 陶小春. 食源性致病菌快速檢測方法研究進展[J]. 醫學理論與實踐, 2014(5): 590-592.

[9]陶光燦, 李勇, 崔廷婷, 等. 酶聯免疫吸附法檢測動物源性食品中氨苯砜殘留[J]. 食品與生物技術學報, 2013, 32(7): 778-783.

[10]YANG J, GUAN G, NIU Q, et al. Development and application of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Borrelia burgdorferi s. l. in Ticks[J]. Transboundary & Emerging Diseases, 2013, 60(3): 238.

[11]龐心怡, 滿朝新, 趙玥明, 等. 環介導等溫擴增技術快速檢測肉中沙門氏菌[J]. 中國食物與營養, 2015, 21(8): 12-15.

[12]張勝凱, 張先舟, 王羽, 等. 環介導等溫擴增技術檢測沙門氏菌反應體系的優化[J]. 安徽農業科學, 2010, 38(22): 11 727-11 729.

[13]LIU C, MAUK M G, HART R, et al. A self-heating cartridge for molecular diagnostics [J]. Lab on A Chip, 2011, 11(16): 2 686.

[14]LIU C, GEVA E, MAUK M, et al. An isothermal amplification reactor with an integrated isolation membrane for point-of-care detection of infectious diseases[J]. Analyst, 2011, 136(10): 2 069-2 076.

[15]SEMA M, ALEMU A, BAYIH A G, et al. Evaluation of non-instrumented nucleic acid amplification by loop-mediated isothermal amplification (NINA-LAMP) for the diagnosis of malaria in Northwest Ethiopia[J]. Malaria Journal, 2015, 14(1): 44.

[16]PAI N P, VADNAIS C, DENKINGER C, et al. Point-of-care testing for infectious diseases: diversity, complexity, and barriers in low-and middle-income countries[J]. Plos Medicine, 2012, 9(9): e1001306-e1001306.

[17]NIEMZ A, FERGUSON T M, BOYLE D S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases[J]. Trends in Biotechnology, 2011, 29(5): 240.

[18]CURTIS K A, RUDOLPH D L, OWEN S M. Sequence-specific detection method for reverse transcription, loop-mediated isothermal amplification of HIV-1[J]. Journal of Medical Virology, 2009, 81(6): 966.

[19]LEE D, KIM Y T, LEE J W, et al. An integrated direct loop-mediated isothermal amplification microdevice incorporated with an immunochromatographic strip for bacteria detection in human whole blood and milk without a sample preparation step[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 79: 273.