低強度脈沖超聲對兔橈骨骨折愈合及小窩蛋白-1基因表達的影響

李　蘊　劉邦忠　劉光華　顧文欽　肖　峰　吳一鳴　高正東　鐘宗燁

(1復旦大學附屬中山醫院康復醫學科　上海　200032;2上海市第七人民醫院病理科　上海　200137;3 上海市徐匯區楓林街道社區衛生服務中心放射科　上海　200030)

骨科康復研究的熱點和難點在于促進骨折修復,縮短愈合時間,促使已經發生的延遲愈合和不愈合重新愈合。物理因子治療被視為重要的干預手段之一。大量體內外實驗證實了低強度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)治療骨折的有效性。LIPUS治療骨折的最佳參數為:超聲頻率1.5 MHz,強度30 mW/cm2,占空比20%,脈沖頻率1 kHz,每日1次,每次20 min。美國FDA分別于1994年及2000年批準將其用于治療新鮮骨折、骨折延遲愈合及骨不連[1]。

LIPUS促進骨折愈合的作用機制尚不清楚。 骨折愈合是一個復雜的生物學過程,涉及到多種細胞及信號分子的改變。小窩蛋白-1(caveolin-1)是細胞膜表面特殊膜結構小窩(caveolae)的重要結構蛋白質之一,它可通過與信號分子的結合調節相應的信號轉導過程[2]。骨折后早期小窩蛋白-1的表達增高[3],但其在LIPUS治療骨折過程中的表達規律還未被證實。本研究旨在通過影像學和組織學檢測明確LIPUS對長管狀骨骨折愈合的影響,并檢測經LIPUS干預后骨折部位小窩蛋白-1的定位、表達及軟骨和骨特異基因的表達,探討小窩蛋白-1在LIPUS治療骨折過程中的作用,從而為闡明LIPUS促進骨折愈合的作用機制提供依據。

材 料 和 方 法

實驗動物健康雄性新西蘭白兔24只,3月齡,體重2.0～2.5 kg,普通級,購自上海生旺實驗動物養殖有限公司。實驗動物分籠飼養于復旦大學實驗動物科學部,全價營養顆粒飼料喂養,自由飲水,室溫控制在(20±2)℃,濕度60%,12 h/12 h間隔照明。

儀器設備低能量骨折愈合儀(日本伊藤超短波株式會社),數字化拍片系統(日本島津制作所),組織切片機(德國Leica公司),全自動免疫組化預處理系統和全自動免疫組化染色系統(丹麥Dako公司),光學顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社),實時熒光定量PCR儀(德國Eppendorf公司)。

主要試劑4%多聚甲醛溶液(武漢谷歌生物科技有限公司),小窩蛋白-1小鼠單克隆抗體(美國 BD公司),二抗檢測系統(丹麥Dako公司),Trizol試劑(美國Sigma公司),逆轉錄試劑盒和qPCR試劑盒(日本TAKARA公司)。

動物模型的建立選取體重相近的健康雄性新西蘭白兔24只,適應性飼養1周后,采用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經耳緣靜脈麻醉,雙側術野處剪毛,75%酒精、活力碘消毒,取雙前肢外側切口,分離周圍肌肉及血管,暴露橈骨中段,注意保護橈動、靜脈,切開并剝離骨膜,使用骨鋸造成橈骨中下1/3處寬為3 mm的橫行骨缺損,深達髓腔的2/3。止血、清創,不予固定,逐層縫合切口。在無菌條件下進行手術,雙側實驗方法相同。術后連續3天肌肉注射40萬單位青霉素鈉,每日1次。術后所有實驗動物分籠飼養,自由活動、進食。

LIPUS干預造模后第2天開始,對實驗動物右側骨折處備皮并行LIPUS刺激。于超聲探頭表面均勻涂抹專用耦合劑,彈性綁帶固定在右前肢骨折處后開啟開關,強度為30 mW/cm2,頻率為1.5 MHz,占空比為20%,重復頻率為1 KHz,每天1次,每次治療20 min。左側作為對照,同時行切斷電源的假刺激。

動物處理每組動物分別在超聲干預的第7、14、21、28天于治療結束后耳緣靜脈給予3%戊巴比妥鈉(0.6 mL/kg)鎮定,進行X線攝片,隨即心內注射空氣處死,在無菌狀態下截取雙側橈骨骨痂組織,用DEPC水處理過的生理鹽水徹底沖洗后縱行劈開平均分成兩部分:一半組織迅速置于無酶凍存管內用液氮速凍,隨后轉入-80 ℃冰箱保存;另一半組織置入4%多聚甲醛溶液(pH=7.4)中。

X線攝片將麻醉鎮靜的新西蘭白兔側臥位擺放于數字化拍片系統檢查床上,拍攝雙前肢正位片。攝片工作由指定放射科技師完成,攝片條件:管電壓56 kV,管電流400 mA,曝光時間110 ms,球管距動物的距離110 cm。所有入組動物攝片結束后,由3位對分組情況不知情的實驗人員統一閱片,并行X線評分。X線評分標準依據文獻報道[4]:骨折未愈合記為0分,有明顯的骨痂形成但骨缺損尚未形成橋接記為1分,有明顯的骨痂形成且骨缺損部位形成可能橋接記為2分,骨折愈合記為3分。所得圖像在萬達區域PACS影像工作站進行刻度校準,使得實物與圖像為1∶1的比例關系,應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行礦化骨痂的圈定,得到像素面積,隨后根據其與整幅圖像像素面積之比計算出實際骨痂面積。

HE染色將固定好的骨痂組織轉入質量分數為30%的鹽酸-多聚甲醛溶液脫鈣3～6天,每24 h更換脫鈣液。脫鈣成功后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,組織浸蠟,縱向石蠟包埋,切片,厚度為3μm。對切片行常規脫蠟,分別移至無水乙醇和95%乙醇中各1 min,自來水沖洗后,將切片移至蘇木精染液內靜置7～10 min。自來水沖洗后在鹽酸乙醇內分化數秒,水洗反藍,移到l%伊紅-乙醇溶液內,對比染色1 min。在95%乙醇Ⅰ、Ⅱ及無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中分別脫水30 s,再經二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全透明各30 s,最后在蓋玻片下以光學樹脂膠封片。光學顯微鏡下觀察骨折愈合的組織病理學變化。

免疫組化染色取石蠟切片用過二甲苯脫蠟3次,每次10 min;100%、90%、80%乙醇梯度水化,每次1 min,蒸餾水漂洗,置于TBST緩沖液中。將切片浸入Tris-EDTA緩沖液(pH=9.0),用全自動免疫組化預處理系統進行抗原修復(95 ℃、17 min),TBST緩沖液中自然冷卻10 min。滴加工作濃度為1∶100的小窩蛋白-1一抗于切片上,室溫45 min孵育;TBST沖洗,滴加10% H2O2溶液,室溫下孵育5 min;TBST沖洗,滴加二抗,室溫下孵育20～30 min;TBST沖洗,滴加DAB溶液,鏡下觀察顯色結果,陽性為棕褐色,待陽性部位出現特異性顯色而背景無著色時,用自來水沖洗終止顯色,蘇木精復染,脫水,封片。每張免疫組化切片隨機選取3個不重疊視野(×400),在光學顯微鏡下拍照,使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量積分吸光度(D),并計算平均值。

實時熒光定量PCR檢測稱取200 mg于-80 ℃冰箱保存的骨痂組織,置入研缽使用液氮均勻研磨,將組織粉末轉入預冷的無酶1.5 mL EP管內,加入1 mL Trizol,使用多樣品組織研磨機勻漿,室溫放置5 min,充分裂解。加入200μL氯仿,混勻,室溫放置3 min。4 ℃、12 000×g離心15 min。盡可能完全吸取上層水相,置于另一1.5 mL EP管中。加入0.5 mL異丙醇,顛倒,室溫靜置10 min。4 ℃、12 000×g離心10 min,棄上清,RNA沉于管底,室溫晾干5～10 min。加入50μL DEPC水溶解RNA樣品,使用超微量微孔板分光光度計測定RNA濃度,按照逆轉錄試劑盒的操作指導將RNA逆轉錄為cDNA,隨后以SYBR Green為熒光染料,進行qPCR檢測,每個樣品的每個基因設置3個復孔。所用引物由上海啟因生物科技有限公司根據NCBI的mRNA序列設計并合成(表 1),數據采用2-ΔΔCt法分析。

結　　　果

X線表現LIPUS干預7天后,雙側骨折線較清晰,無明顯骨痂形成。第14天時,雙側骨折線開始模糊,實驗側骨膜反應較強,形成的骨痂較對照側明顯,且骨缺損部位大部分被新生骨痂充填。第21天時,對照側骨缺損部位有明顯的骨痂形成,但實驗側骨痂含量仍顯著多于對照側,骨缺損部位完全被新生骨痂充填并可能形成橋接。治療28天后,實驗側骨痂面積顯著大于對照側,骨皮質連續性也基本恢復,對照側尚未形成完全的骨性橋接(圖 1A)。

表 1　目的基因引物序列Tab 1　The primer sequence of target genes

A:Radiographs;B:Radiographic score;C:Mineralized callus area.vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.

圖1術后各時間點兔橈骨的影像學改變
Fig1Radiologicalchangesintheradiusofrabbitsatdifferenttimepointsafterthesurgery

X線評分LIPUS干預7天后,雙側橈骨均無明顯骨折愈合證據。第14天,實驗側X線評分顯著高于對照側(P=0.017),第21、28天實驗側X線評分顯著高于對照側(P均為0.005)。雙側橈骨X線評分均隨治療時間延長而升高,各時間點間差異有統計學意義(P均<0.001,圖 1B)。

礦化骨痂面積術后第7天,雙側橈骨均無明顯礦化骨痂生成,自第14天起,礦化骨痂面積迅速增加,實驗側顯著大于對照側(14天:P=0.003;21天:P<0.001;28天:P=0.004)。 雙側橈骨礦化骨痂面積總體呈逐漸增加的趨勢,不同時間點間礦化骨痂面積差異有統計學意義(P均<0.001,圖 1C)。

組織學觀察造模后第7天,對照側仍存在一定量的纖維肉芽組織,并可見由骨折斷端間充質細胞分化而來的幼稚的軟骨細胞大量增殖;實驗側軟骨細胞持續增殖并逐漸向肥大軟骨細胞分化,出現大片軟骨島。治療14天后,對照側軟骨細胞持續大量增殖、分化,形成軟骨基質,少數軟骨細胞凋亡,來自骨外膜的破骨細胞侵入并溶解吸收鈣化的軟骨基質,間充質細胞分化為成骨細胞,在殘存的軟骨基質表面成骨,開始形成原始骨小梁;實驗側軟骨細胞肥大、退變,軟骨基質鈣化,骨小梁粗而長,可見成骨細胞、破骨細胞沿骨小梁排布。第21天,對照側軟骨細胞開始退化、凋亡,軟骨內成骨普遍,骨小梁相互連接成網;實驗側大量軟骨細胞退化、死亡,破骨細胞多見,骨小梁呈編織樣。治療28天后,對照側軟骨細胞逐漸退化,軟骨基質鈣化明顯,骨小梁接連成片;實驗側編織骨逐漸向板層骨過渡,骨小梁內可見較多成熟的骨細胞(圖 2)。

小窩蛋白-1免疫組化染色造模后第7天,骨折部位小窩蛋白-1多定位于軟骨細胞核,實驗側骨折部位軟骨細胞小窩蛋白-1水平明顯高于對照側(P=0.002)。14天后,雙側橈骨骨折部位小窩蛋白-1水平均有明顯增高,主要定位于肥大軟骨細胞膜及間充質細胞,實驗側小窩蛋白-1水平顯著高于對照側(P<0.001)。第21天,伴隨軟骨細胞的退變、凋亡,軟骨細胞的小窩蛋白-1水平降低;間充質細胞遷移至軟骨基質表面并逐漸向成骨細胞分化,小窩蛋白-1水平隨之降低,且實驗側顯著低于對照側(P=0.001)。治療28天后,軟骨細胞逐漸退化、凋亡,小窩蛋白-1水平很低;大量間充質細胞分化為成骨細胞成骨,小窩蛋白-1水平下降,實驗側顯著低于對照側(P=0.017,圖 3)。在骨折愈合過程中,小窩蛋白-1水平呈現先上升后下降的規律,不同時間點小窩蛋白-1水平差異有統計學意義(對照側:P<0.001,實驗側:P<0.001,圖 4)。

圖 2　術后各時間點兔橈骨骨折部位組織學改變(HE染色,×100)Fig 2　Histological changes in radius fracture sites of rabbits at different time points after the surgery (HE staining,×100)

實時熒光定量PCR結果顯示(圖5):術后7、14天,小窩蛋白-1基因表達增加,且第7天時實驗側顯著高于對照側(P=0.028);術后21、28天,小窩蛋白-1基因表達降低,實驗側表達水平反而低于對照側,與21天時相比差異有統計學意義(P<0.001)。在骨折愈合過程中隨時間的延長Col2a1基

圖3　術后各時間點兔橈骨骨折部位小窩蛋白-1的免疫組化染色(HE染色,×200)Fig 3　Immunohistochemistry of caveolin-1 in radius fracture sites of rabbits at different time points after the surgery (HE staining,×200)

vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.

圖4術后各時間點兔橈骨骨折部位小窩蛋白-1水平
Fig4Caveolin-1levelsinradiusfracturesitesofrabbitsatdifferenttimepointsafterthesurgery

因相對表達量下降,術后7、14天實驗側表達均顯著高于對照側(P=0.002,P=0.03);術后21、28天,實驗側表達顯著低于對照側(P=0.025,P=0.006)。術后7、14天,Col10a1表達增加,實驗側顯著高于對照側(P均為0.01);此后表達下降,21天時實驗側顯著低于對照側(P=0.031)。術后7、14天,骨鈣蛋白基因表達增加,實驗側顯著高于對照側(P=0.001,P=0.012),第21、28天時表達下降,實驗側顯著低于對照側(P均為0.003)。

討　　　論

促進軟骨內成骨是LIPUS加速長管狀骨骨折愈合的重要機制研究證實LIPUS加速骨痂的形成,骨痂面積顯著增加[5]。長管狀骨骨折后軟骨痂以軟骨成分為主,軟骨內成骨在其骨折修復中扮演重要角色[6]。組織學觀察發現LIPUS干預使軟骨內成骨、硬骨痂橋接等提前出現[7];體外實驗也證實LIPUS可以促進間充質細胞向軟骨細胞分化,促進軟骨細胞的增殖、分化,影響軟骨基質的形成[8-9]。本研究發現:實驗側礦化骨痂、骨性橋接出現的時間較對照側早,自第14天開始,實驗側X線評分、礦化骨痂面積均顯著高于對照側;組織學結果也表明,實驗側骨痂組織軟骨細胞在前14天更多、更成熟,軟骨基質鈣化、軟骨細胞凋亡以及原始骨小梁出現的時間點較早,這與既往研究結果一致。

軟骨及骨特異基因的表達情況同樣驗證了LIPUS的促成骨效應。軟骨細胞的程序性分化是軟骨內成骨的重要環節之一,是幼稚的增殖性軟骨細胞向成熟的肥大軟骨細胞的轉變過程。軟骨細胞在早期分化增殖過程中會產生包括Ⅱ型膠原在內的大量基質蛋白,而在肥大化的過程中可以分泌Ⅹ型膠原,因此Col2a1及Col10a1分別被認為是軟骨細胞增殖及肥大的標志基因[10]。本實驗中軟骨特異基因的表達規律說明:造模后形成的骨痂內,增殖性軟骨細胞數量在各時間點呈現逐漸下降的趨勢,軟骨細胞經歷逐漸肥大化隨后凋亡的過程。術后第7、14天,超聲治療側骨痂內上述兩基因的表達明顯高于對照側,說明超聲刺激促進了骨痂內部軟骨細胞的增殖分化進程。第21天開始,上述兩基因在實驗側的表達低于對照側,這可能與軟骨細胞提前分化進入終末期并發生凋亡有關。骨鈣蛋白是由成骨細胞合成并分泌的一種非膠原骨蛋白,可以反映成骨細胞的活性,其表達隨成骨細胞的分化而增加,并隨其轉變為骨細胞而下降[11]。本研究發現:術后第7、14天,在LIPUS刺激下成骨細胞分化程度增高;隨后,成骨細胞分泌類骨質并逐漸向骨細胞轉變,實驗側的成熟骨細胞較對照側多,因此可以解釋第21、28天實驗側骨鈣蛋白表達水平低于對照側。已知膜內成骨稍快于軟骨內成骨并共同參與骨折部位原始骨痂的形成,本研究中qPCR實驗測得的骨鈣蛋白來自參與上述兩過程的成骨細胞,這也是前2周骨鈣蛋白表達先增加后下降的原因之一。結合組織學觀察結果,可以認為LIPUS能夠促進骨折愈合過程中成骨細胞的活性及其分化成熟。

vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.The data represents at least 3 independent experiments.

圖5術后各時間點小窩蛋白-1(A),Col2a1(B),Col10a1(C)及骨鈣蛋白(D)的mRNA相對水平
Fig5TherelativemRNAlevelofcaveolin-1(A),Col2a1(B),Col10a1(C)andosteocalcin(D)atdifferenttimepointsafterthesurgery

LIPUS通過改變小窩蛋白-1的表達促進骨折愈合LIPUS作為一種高頻低張的機械波,可以通過機械效應、熱效應等改變細胞的物理微環境。目前認為LIPUS可以傳播至骨痂軟組織及礦化組織形成的多孔網絡內部,并在這些孔隙內產生流體微動,從而調節細胞外基質的產生,施加剪應力激活細胞膜表面的機械性刺激感受器[1]。因此,LIPUS促進骨折愈合與機械信號的呈遞密切相關。

小窩是呈燒瓶狀的特異細胞膜內陷微區,對機械刺激敏感[12],參與包括信號轉導在內的眾多生物學過程。小窩蛋白是組成小窩的重要結構蛋白,有3個亞型:小窩蛋白-1、2、3。小窩主要通過小窩蛋白-1的“腳手架”結構域與各信號分子的催化亞基結合,參與信號轉導的調節。小窩蛋白不僅定位于細胞質膜,還存在于細胞核及多種細胞器中。

小窩蛋白-1可能參與骨折愈合的信號轉導。Rubin等[13]發現小窩蛋白-1基因敲除小鼠的骨體積及強度顯著增加。Tang等[3]發現骨折后外周血單個核細胞中小窩蛋白-1基因表達水平升高,并在骨折后第9～12天達到高峰。Baker等[14]指出間充質細胞向成骨細胞分化的過程中,小窩蛋白-1基因表達增加,阻止其進一步分化,被視為一種負反饋機制。Hollins等[15]通過檢測小窩蛋白-1在雞胚胎軟骨形成中的表達,發現其在軟骨發育過程中表達增加,推測其可能參與軟骨細胞分化的調控。我們在前期研究中也發現,大鼠骨折愈合早期骨痂中軟骨細胞分布區可見小窩蛋白-1表達顯著,隨著軟骨細胞消失其水平下降[16]。

本研究發現,術后第7、14天,實驗側軟骨細胞增殖分化程度均高于對照側。造模后7天可見軟骨細胞小窩蛋白-1主要定位在細胞核,實驗側表達量明顯高于對照側。已知小窩蛋白-1可通過與共定位于小窩內的信號分子的核轉位控制細胞增殖相關基因的啟動[2]。Sedding等[17]在體外培養血管平滑肌細胞的研究中發現:在機械應力增加的情況下,小窩蛋白-1可以促進其細胞周期進程。以上結果提示LIPUS可能通過小窩蛋白-1的核轉位促進軟骨細胞的增殖。術后第14天,雙側骨痂小窩蛋白-1表達均有明顯增加,主要定位于肥大軟骨細胞膜,實驗側表達量顯著高于對照側。目前已知小窩蛋白-1參與調控軟骨細胞的分化[15],說明LIPUS可通過上調小窩蛋白-1的表達促進軟骨細胞的肥大化。第21、28天,軟骨細胞退變、凋亡,間充質細胞小窩蛋白-1蛋白質水平在向成骨細胞分化過程中降低,實驗側明顯低于對照側。研究發現敲除小窩蛋白-1基因后促進間充質細胞分化為成骨細胞[14],提示LIPUS可能通過下調小窩蛋白-1的表達促進間充質細胞向成骨細胞分化。小窩蛋白-1 mRNA水平也呈現類似的規律,但第7、28天雙側骨痂表達差異無統計學意義,這可能與骨折愈合過程相互交織的特性有關,即骨痂組織內部不僅含有增殖分化的軟骨細胞,還含有向成骨細胞分化的間充質細胞。

綜上所述,促進軟骨內成骨是LIPUS加速長管狀骨骨折愈合的重要機制,在這個過程中小窩蛋白-1可能發揮了重要的作用:在軟骨痂形成期,LIPUS可能通過上調小窩蛋白-1的表達促進軟骨細胞的增殖、分化;在硬骨痂形成期,在LIPUS的作用下,小窩蛋白-1基因表達降低,間充質細胞逐漸向成骨細胞分化并成骨。我們的后續研究將對產生上述效應的具體信號轉導通路和靶基因進行進一步探索。

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