PCR探針熔解曲線法在對(duì)肺結(jié)核患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用效果

常鳳霞

（青海省第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海 西寧 810000）

耐多藥結(jié)核病是一種對(duì)利福平及異煙肼同時(shí)具有耐藥性的結(jié)核病。此病屬于結(jié)核病治療中的重點(diǎn)及難點(diǎn)[1]。對(duì)耐多藥結(jié)核病患者的病情及時(shí)進(jìn)行診斷，并動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)其結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，是為其制定有效的抗結(jié)核化療方案的關(guān)鍵[2]。目前，臨床上對(duì)耐多藥結(jié)核病患者結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)的主要方法是進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)。但是，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)較為費(fèi)時(shí)，且存在標(biāo)準(zhǔn)化困難等缺點(diǎn)[2]。結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)具有用時(shí)短、可有效縮短臨床用藥指導(dǎo)的時(shí)間等優(yōu)勢(shì)[3]。本次研究主要探討PCR探針熔解曲線法在對(duì)肺結(jié)核患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對(duì)象為2018年1月至2018年3月期間在青海省第四人民醫(yī)院門診或住院部接受治療20例肺結(jié)核患者。

1.2 研究方法

使用PCR探針熔解曲線法對(duì)這20例患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥性進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，方法是：1）采集患者3～5 mL的痰液作為檢測(cè)標(biāo)本。2）對(duì)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒別及藥敏試驗(yàn)，然后從中分離出20株結(jié)核分枝桿菌。另取30株野生型結(jié)核分枝桿菌（H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株，由國家結(jié)核病研究所提供）。3）對(duì)這50株結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥性進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，方法是：⑴本次研究使用的試劑與儀器有PCR試劑[由生工生物工程（上海）有限公司生產(chǎn)]，結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥突變檢測(cè)試劑盒（由廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)），PCR儀（由德國羅氏公司生產(chǎn)）。⑵對(duì)這50株待檢結(jié)核分枝桿菌的菌株進(jìn)行復(fù)活、接種及滅活，然后采用煮沸法提取菌株中的基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行加樣。⑶分別設(shè)立陰性DNA5 td和陽性對(duì)照品DNA5 td。對(duì)這50株菌株進(jìn)行擴(kuò)增后，使用PCR探針熔解曲線法檢測(cè)其對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的基因突變情況。獲取這50株菌株對(duì)上述四種抗結(jié)核藥物的耐藥情況。其中，使用利福平進(jìn)行檢測(cè)時(shí)菌株復(fù)合群rpoB基因在27個(gè)氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)存在的突變的情況；使用異煙肼進(jìn)行檢測(cè)時(shí)菌株ahpC啟動(dòng)子區(qū)、inhA94密碼子區(qū)及inhA啟動(dòng)子區(qū)、katG315密碼子區(qū)內(nèi)存在突變的情況；使用乙胺丁醇進(jìn)行檢測(cè)時(shí)菌株在embB306、embB497、embB368、embB378、embB 380及embB406位密碼子存在突變的情況；使用鏈霉素進(jìn)行檢測(cè)時(shí)菌株在rpsL基因43位密碼子、基因88位密碼子、TTS基因513～517位點(diǎn)及TTS基因905～908位點(diǎn)存在突變的情況。

1.3 觀察指標(biāo)

以藥敏試驗(yàn)的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，觀察這20例患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥表型的一致性。

2 結(jié)果

這20例患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)的結(jié)果與利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥表型的一致性分別為：利福平為98%（49/50）、異煙肼為96%（48/50）、乙胺丁醇為62%（31/50）、鏈霉素為76%（38/50）。這些患者的結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與利福平、異煙肼耐藥表型的一致性較高，其結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與乙胺丁醇、鏈霉素耐藥表型的一致性較低。

3 討論

相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，引起結(jié)核分枝桿菌發(fā)生耐藥的分子機(jī)制與其存在基因突變有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌發(fā)生不同的基因突變，會(huì)導(dǎo)致其對(duì)不同藥物產(chǎn)生耐受性[2，4]。對(duì)耐多藥肺結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）可快速地了解患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的位點(diǎn)是否發(fā)生突變，有利于對(duì)患者的用藥種類進(jìn)行篩選。2）可在對(duì)患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)的藥學(xué)監(jiān)測(cè)，及時(shí)了解其結(jié)核分枝桿菌菌株的耐藥信息、耐藥基因突變位點(diǎn)的變化，有利于準(zhǔn)確地找到其體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌株產(chǎn)生耐藥的原因，便于有針對(duì)性地為其調(diào)整治療方案。3）可有效地阻斷患者耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播途徑，有助于控制其病情的進(jìn)展[5]。有研究表明，PCR技術(shù)可以把擴(kuò)增與檢測(cè)合二為一，可實(shí)時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增及檢測(cè)，能夠在同一時(shí)間檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥的多個(gè)相關(guān)基因突變情況，具有高效、便捷等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于臨床上對(duì)大批量基因突變的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行篩查[3，5]。本次研究的結(jié)果顯示，這些患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與利福平、異煙肼耐藥表型的一致性較高，其體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與乙胺丁醇、鏈霉素耐藥表型的一致性較低。此研究結(jié)果與胡春梅等[5]的研究結(jié)果相符。

綜上所述，PCR探針熔解曲線法在對(duì)肺結(jié)核患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用效果顯著，可迅速地篩查出患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平等常用一線抗結(jié)核藥的耐藥情況。