靶向兔肌肉生長抑制素基因CRISPR/Cas9載體的構建和活性分析

尤　雙， 曹　洋， 李村院， 魏軍昌， 李曉悅， 張翔宇， 姚　洋， 胡圣偉， 倪　偉

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832000)

基因編輯技術已經發展成為研究基因功能的工具，在生物醫學研究和農業上改善動物特性，從而產生基因修飾動物模型。CRISPR/Cas9系統包括1個單鏈導向RNA(sgRNA)和1個人類的優化密碼子Cas9核酸酶，通過非同源末端連接(簡稱NHEJ)能夠誘導靶突變。

家兔在生物分子研究中是一個很有發展前景的動物模型，它們與人類在生理學和解剖學等方面比小鼠和大鼠更相似，而且與豬和猴[1]相比，飼養費用低、妊娠時間短[2]。因此，選擇用基因敲除的兔作為疾病動物模型，為探索和研究人類疾病機制、治療性藥物篩選提供了重要研究工具。現有研究顯示，基因敲除家兔是研究肥厚型心肌病、脂類代謝和動脈粥樣硬化的極佳模型[3-6]。Myostatin(簡稱MSTN)又稱GDF-8，屬于轉化生長因子超級族(transforming growth factor bata，簡稱TGF-β)。它用于反向調節肌肉生長[7-8]。已經有報道表明，MSTN的自然突變在牛、綿羊[9-10]身上造成肌肉的過度生長。增加肌肉組織的雙肌表型特征在MSTN 敲除綿羊、豬和狗[11-13]身上也已經獲得，從而鼓勵我們研究MSTN敲除兔，用于研究肌肉的發展，以便將來在農業上提升動物特性。

目前，細胞轉染外源基因最常用的高效方法有脂質體介導轉染、病毒介導轉染和電穿孔法。電穿孔是外加電場造成細胞質膜暫時性結構改變形成可恢復空隙時，將外源基因轉移到細胞的過程，此方法操作具有簡單、快捷、可重復性強、適應性廣等優點[14]。

本試驗通過使用 Lonza Nucleofector 設備，對家兔的成纖維細胞進行電轉，驗證了CRISPR/Cas9系統介導的基因編輯的高效性，為后續獲得MSTN敲除兔打下基礎。

1　材料和方法

1.1　主要試劑及儀器

Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa)，質粒小提試劑盒(離心柱型)(TIANGEN)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(普通離心柱型)(TIANGEN)，BbsⅠ(NEB)，DL10000 DNA marker、DL2000 DNA marker[寶生物工程(大連)有限公司]，感受態菌DH5α(實驗室自制)，引物合成和測序由Invitrogen公司完成。青霉素-鏈霉素溶液，DMEM高糖培養液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，P3 Primary cell 4D-Nucleofector×Kit L(24RCT)(Lonza 公司，德國)，無內毒素質粒大抽提取試劑盒(TIANGEN)；Lonza 4D-Nucleofector 電轉儀(Lonza 公司，德國)，冰箱(海爾集團，中國)，移液器(Eppendorf 公司，德國)，CO2恒溫培養箱(Sanyo 公司，日本)，超凈工作臺(Baker 公司，中國)，凍存盒(Nalgene，美國)，0.22μm 微孔濾膜(Millipore 公司，美國)，倒置相差顯微鏡(Nikon，德國)。

1.2　方法

1.2.1sgRNA設計和合成根據GenBank中公布的兔MSTN基因序列(序列號：AM931157.1)，利用CRISPR/Cas9在線設計工具(http：//tools.genomeenging.org)設計sgRNA。選擇DNA的正義鏈或反義鏈的序列GGN18NGG或GGN17NGG作為靶位點。引物見表1，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行化學合成。

1.2.2Cas9/gRNA表達載體的構建將sgRNA上下游引物配制為100 μmol/L濃度，各取10 μL混合，于95 ℃水浴 5 min 后，關閉水浴鍋，在水浴中自然緩慢降溫至室溫退火。用限制性內切酶BbsⅠ(NEB)切割PX330載體，使其線性化。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒

表1　PCR反應引物

(TIANGEN)回收CRISPR/Cas9線性化載體。線性化載體與退火的sgRNA用T4連接酶于16 ℃連接過夜，轉化至DH5α感受態菌中，2 d后挑取單克隆，保菌并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3兔成纖維細胞的分離及培養選擇懷孕約15～20 d的新西蘭母兔處死，取出子宮，放在培養皿中。無菌條件下取出胎兒，剪去頭、尾、四肢并去除內臟，在超凈臺上，用含 100 mg/L 青霉素和 100 mg/L鏈霉素的無菌磷酸緩沖鹽溶液(簡稱PBS)將上述預處理的部分組織漂洗 3～5遍，在無菌培養皿中用眼科剪剪切成約1 mm3的小塊，采用組織塊培養法，獲得原代成纖維細胞。然后進行常規的原代和傳代培養，或冷凍保存或用于轉染。

兔成纖維細胞培養采用DMEM培養液(含15%胎牛血清)，37 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養。當細胞生長至匯合度為90%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心 8 min。洗滌收集細胞，用于電轉染和細胞基因組檢測。

1.2.4電轉染按照Lonza Nucleofector電轉儀操作說明，82 μL S1溶液和18 μL S2溶液。收集1.0×106個細胞，加入5 μg除內毒素的Cas9/gRNA質粒，用100 μL電轉液混合懸浮細胞，混勻后轉入電轉杯中。選擇小鼠胚胎成纖維細胞程序EH-100，對兔胚胎成纖維細胞實施電轉。電轉結束后靜置10 min，將電轉細胞轉入提前溫育的20% FBS培養液的6孔板中，37 ℃，5.0% CO2飽和濕度培養，5～6 h后換液。轉染24 h后，轉放于30 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養，48 h后，再于37 ℃培養。待細胞長滿，收集細胞，提取細胞基因組。

2　結果與分析

2.1　sgRNA設計

利用CRISPR/Cas9在線設計工具(http：//tools.genomeenging.org)，針對家兔MSTN基因的CDs區設計了sgRNA(圖1)。MSTN基因外顯子3為生物活性區。為了失活MSTN外顯子3，選擇靶位點位于MSTN基因第二外顯子區的sgRNA用于后續研究。

2.2　Cas9/gRNA表達載體的構建和鑒定

通過質粒小提試劑盒，提取PX330質粒。BbsⅠ酶切后，由圖2可知，酶切后的PX330為單一條帶，而對照質粒為2條條帶，表明酶切成功。切膠回收后與gDNA按一定比例，16 ℃ 水浴過夜連接。將連接產物通過熱激轉化法導入感受態菌DH5α，小量擴增。2 d后挑單克隆菌落，過夜搖菌擴增，保菌并送測序。測序結果表明，sgRNA成功連入PX330質粒(圖3)，Cas9/gRNA表達質粒pCas9/gRNA構建成功。

2.3　EGFP表達及轉染效率

由于CRISPR/Cas質粒沒有熒光表達信號，于是將EGFP質粒與pCas9/gRNA質粒共5 μg轉染家兔成纖維細胞，共轉染的細胞表達熒光，表明電轉染質粒表達成功。核轉染24 h后，可見綠色熒光表達，細胞生長迅速，活力良好(圖4)。

2.4　Cas9/gRNA敲除效率

核轉染3d后，觀察細胞生長至80%～90%時，收集細胞，提取細胞總DNA，通過PCR擴增出目的條帶，連接pMD19-T載體，隨機挑取13個單克隆進行測序。由圖5可知，3個克隆中的MSTN基因發生了突變，其中2個克隆出現了相同類型的堿基缺失(CA堿基缺失)，另一個出現了單堿基突變(A突變為G)。經計算pCas9/gRNA載體的基因突變效率為23%。

3　討論

CRISPR/Cas9系統是發展最為迅猛的基因編輯技術，它不僅效率高、適應面廣，且操作簡單、周期相對較短。越來越多地取代ES打靶技術基因組特定位點的修飾，這讓基因編輯技術的廣泛應用和普及成為可能。近年來，相當多的報道提到應用CRISPR/Cas9方法在不同物種中實現了基因敲除、插入和突變。

原則上，所有個體都可作為組織細胞的供體，但同樣細胞來自幼年個體比來自老年個體的易于培養；來自同一個體的組織，分化程度低的組織細胞比分化程度高的容易培養。因此，在試驗取材時，本試驗選用了 15～20 日齡的家兔胚胎作為成纖維細胞的供體。

電轉染對細胞的生長狀態要求比較嚴格，細胞傳代最好在 6 代以內且生長狀態良好，細胞密度達到 70%～80%融合時最適宜做電轉染[15]，細胞密度太高，影響細胞的生長，會導致轉染效率的降低。因此，在進行細胞轉染時，選用的是第三代細胞，并且細胞密度達到約80%開始進行試驗。

本試驗通過使用 Lonza Nucleofector 設備，對家兔的成纖維細胞進行電轉，將EGFP質粒與pCas9/gRNA質粒共轉染家兔成纖維細胞，從而驗證筆者構建的pCas9/gRNA質粒在細胞水平上對MSTN的敲除效率，筆者初步驗證Cas9/gRNA的敲除效率約為23%，為下一步進行胚胎顯微注射和體細胞克隆技術制備MSTN基因敲除家兔奠定基礎。

在本試驗中，構建的重組質粒對家兔成纖維細胞進行轉染時，因使用的核轉染儀中沒有專門針對轉染家兔的成纖維細胞設定的程序，所以選用綿羊成纖維細胞轉染程序進行轉染，可能對試驗結果有一定的影響。

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