無機硒及富硒藻對萼花臂尾輪蟲種群增長的影響

許歡歡， 蘇宇琦， 郭　蕾， 羅玉霞， 單雨燕， 劉露露， 郁晴雯， 楊家新

(南京師范大學/江蘇省水產生物餌料重點實驗室，江蘇南京 210023)

藻類具有高效的生物吸附功能，對硒的生物循環至關重要。藻類本身又含有豐富的維生素、蛋白質等多種活性物質，能富集多種微量元素。當硒攝入藻體內可與脂、多糖及蛋白結合，形成硒蛋白而轉化為有機硒，并通過食物鏈傳給其他消費者，成為最佳的生物富集體和硒生物轉化載體之一[1]。在水產養殖中，利用小球藻的生物轉化功能將無機硒轉化為有機硒，獲得富硒小球藻，從而能夠將硒傳遞給萼花臂尾輪蟲，再將其投喂魚苗，以評價硒對輪蟲乃至魚苗的影響，可為未來水產生物餌料研究指明方向。

硒作為水生生態系統中一種基本微量元素，在低濃度較窄范圍內促進藻類生長，超過該范圍就會對藻類產生毒性效應，抑制其生長，同時硒也會通過食物鏈傳遞在高級消費者體內累積，對機體產生毒害。通常而言，硒在非污染水體中通常濃度為0.01～0.20 mg/L[2]，但是在污染的水體中濃度高達1 600 mg/L[3]。

呂蓉等認為，硒濃度超過1 mg/L對小球藻生長產生抑制，12 mg/L幾乎停止生長，4～8 mg/L生物富集效果顯著[4]。但也有研究表明，小球藻可以耐受較高濃度的硒。Pelah等通過胞內反應試驗表明，小球藻細胞最高能夠承受100 mg/L亞硒酸鈉[5]。Chen等發現硒在適宜濃度下可以促進小球藻的生長，但當硒濃度達到500 mg/L時對小球藻的生長產生抑制作用[6]。

關于硒對微藻的作用機制，通過75Se同位素追蹤技術對一些海洋微藻的研究發現，一個依靠ATP的主動運輸，與亞硒酸鹽的親和力較高；另一個是被動運輸，與亞硒酸的親和力較低[7-8]。雖然硒代謝的具體途徑仍然未知，但硒酸鹽和亞硒酸鹽在高等植物中可能遵循相同的代謝途徑[9]。在代謝過程中，硒酸鹽和亞硒酸鹽轉變為硒化物(Se2-)，進一步通過SeCys嵌入機制整合為特異性蛋白[10]，或代謝為SeMet，SeMet可進一步代謝為揮發性二甲基硒(DMSe)[11]，或者在一些微藻細胞中積累[12-14]。而SeCys也可進一步被代謝為硒甲基硒代半胱氨酸[8，15]。

本試驗以輪蟲餌料微藻——蛋白核小球藻和萼花臂尾輪蟲為研究對象，研究硒在生物餌料養殖中的最適添加量。探討既能滿足對輪蟲營養強化要求，又能促進藻類的種群增長、提高其抗氧化能力及生存活力的方法。并以輪蟲作為載體，通過強化培養改善輪蟲營養結構，將所需的營養物質傳遞給苗種，提高幼苗成活率，為生物餌料的營養強化提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

試驗用萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus) (Florida，USA，1983品系)[16]，由休眠卵孵化培養而得，每24 h更換1次EPA培養基(KCl 4 mg/L，NaHCO396 mg/L，CaSO4·2H2O 60 mg/L，MgSO4·7H2O 123 mg/L)。投喂密度約為3×106cells/mL 的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，并置于25 ℃恒溫培養箱培養，光照度為2 000 lx，光—暗周期為 16 h—8 h。蛋白核小球藻培養條件：光照度約為2 000 lx，光—暗周期為16 h—8 h，25 ℃恒溫培養，定期搖勻培養液使小球藻懸浮，并每天更換培養基，具體培養條件參考楊家新等方法[17]。

本試驗所用蛋白核小球藻購自中國科學院水生生物研究所，保存于光照培養箱內，并定期純化、擴培，避免其污染、退化。

1.2　試驗藥品

Na2SeO3(sodium selenite)購自Amresco公司，純度>98%。相對分子質量為173，Se含量約為45.7%。用超純水溶解并配制母液。

1.3　小球藻的生長及其富硒能力試驗

稱取40 mg Na2SeO3溶于40 mL超純水，配制1 g/L亞硒酸鈉貯備液備用，設置不同濃度梯度亞硒酸鈉(0、10、20、40、60、80、100 mg/L)溶解液(其中硒有效濃度分別約為0.00、4.57、9.14、18.28、27.42、38.00、45.70 mg/L)的BBM培養基。在超凈操作臺中接種20 mL 6×104cell/mL蛋白核小球藻于不同硒濃度的培養基中，然后置于25℃恒溫培養箱培養。每天定時搖瓶2～3次，每組3個平行。采用分光光度法測定蛋白核小球藻的生物量，自接種日起每隔2 d定時取樣測定。取濃縮藻液逐級稀釋1、5、10、20倍，通過血球計數板進行計數，并在分光光度計下測定650 nm處的吸光度(D650 nm)。擬合藻細胞密度和吸光度得到曲線y=9.059 5x-0.068 4(x為D650 nm，y為藻密度)。

10 d后將所有處理組藻液移至50 mL離心管內，在轉速 6 000 r/min 下離心12 min，去上清液，再用超純水洗滌離心收集藻濃縮液，真空冷凍干燥，獲得藻粉。用電感耦合等離子發射光譜儀(ICP)測定藻體的含硒量。

1.4　硒直接暴露試驗

取亞硒酸鈉貯備液，設置0.00(CK)、0.05、0.10、0.20和 0.40 mg/L 組(其中硒有效含量分別約為0.00、0.02、0.04、0.09和0.18 mg/L)濃度梯度亞硒酸鈉。取齡期<2 h的輪蟲幼體置于6孔細胞培養板中，6 只/孔，每孔6 mL EPA培養基，投喂密度為3×106cells/mL的小球藻，每組6個平行。每24 h觀察、統計輪蟲數，同時更換培養基，試驗進行4 d。

1.5　富硒藻投喂試驗

試驗組濃度設置同“1.4”節。分別取100 mL 6萬cell/mL 蛋白核小球藻接種于500 mL含5組不同濃度亞硒酸鈉的BBM培養基中，每組3個重復。進行24 h光照、25 ℃ 連續曝氣培養，在培養的3 d每組再次加入500 mL與起始培養濃度相同的亞硒酸鈉BBM培養基繼續培養。4 d后將所有試驗組藻液移至離心管中，6 000 r/min離心12 min，移去上清液，用超純水洗滌并離心，收集不同濃度硒培養的藻濃縮液。取齡期<2 h的輪蟲幼體30個平分于5個孔，于6孔細胞培養板中進行培養，每孔6 mL EPA培養基，分別用5組不同濃度富硒藻3×106cells/mL投喂，每組6個平行。每 24 h觀察、統計輪蟲數，同時更換培養基，試驗進行4 d。

1.6　數據處理

藻體生長速率及世代時間：K=2.303(lgN-lgN0)/t，T=0.693/K。式中：K表示比生長速率(d-1)，N0表示初始藻密度，N表示td后的藻密度(cells/mL)，t表示生長時間(d)，T表示平均世代時間(d)。

輪蟲種群增長率：r=(lnNt-lnN0)/T。式中：N0表示初始輪蟲數(個)，Nt表示Td后的輪蟲數(個)，T表示培養時間(d)。

試驗數據采用Excel 2007 和SigmaPlot 11.0進行方差和差異顯著性分析(one-way ANOVA)，P<0.05即為有顯著差異。

2　結果與分析

2.1　小球藻在不同硒濃度下生長情況

由圖1和表1結果可知，不同亞硒酸鈉濃度下小球藻密度、比生長速率、平均世代時間3個參數均表現出一種上下波動狀態，但硒濃度的變化未引起小球藻生長的顯著差異。前4 d，對照組和各濃度處理組均處于緩慢生長階段，各組增長速率無明顯差異，藻液顏色也都與初始狀態相似；4 d之后，各處理組進入指數增長期，小球藻生長速率明顯上升，藻液顏色逐漸加深；直至10 d，各試驗組仍處于較快增長階段，但藻液顏色外觀無明顯差異。

表1　小球藻在不同硒濃度下的變化

2.2　小球藻在不同硒濃度下富集情況

圖2表明，亞硒酸鈉在0～100 mg/L范圍內，小球藻對硒元素的富集效果隨著硒濃度的升高而增加。亞硒酸鈉濃度在10～80 mg/L時，藻體含硒量呈指數型增長。電感耦合等離子體質譜儀(ICP)測定表明，各處理組小球藻富集硒的含量分別為470.33、891.17、1 231.82、1 598.89、2 065.13和 2 172.66 mg/kg，分別是非富硒培養時的1.32、2.49、3.45、4.48、5.78和6.08倍，顯著高于對照組[(357.24±29.11) mg/kg；P<0.05]。可見，蛋白核小球藻對Se的富硒能力比較明顯。

2.3　無機硒對萼花臂尾輪蟲種群增長的影響

暴露在不同濃度亞硒酸鈉溶液中萼花臂尾輪蟲的種群增長率變化見圖3。各試驗組的種群增長率均高于對照組，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，呈現出先上升后下降的趨勢但仍高于對照組。根據差異顯著性分析，亞硒酸鈉濃度為0.1、0.2和0.4 mg/L時，其種群增長率顯著高于對照組(P<0.05)，r分別上升了12.76%、16.76%和14.22%。而0.05 mg/L處理組與對照組相比無明顯差異，其r僅上升了8.69%。

2.4　富硒小球藻對萼花臂尾輪蟲種群增長的影響

暴露在含有不同濃度亞硒酸鈉培養的富硒小球藻的環境中萼花臂尾輪蟲的種群增長率變化見圖4。隨著硒濃度的逐漸上升，各試驗組的種群增長率均低于對照組。差異顯著性分析顯示，富硒小球藻對其種群增長有顯著抑制(P<0.05)。與對照組相比，各試驗組的r分別下降了36.94%、40.96%、17.63%、28.44%，其中0.05、0.10、0.40 mg/L濃度組表現出明顯差異(P<0.05)，而0.2 mg/L試驗組則與對照組相比無顯著差異。

3　討論與結論

3.1　不同硒濃度對小球藻種群增長和富硒的影響

生物體內以GSH-Px為活性中心，在一定硒濃度范圍內，提高谷胱甘肽過氧化物酶活性及抗氧化性，能夠促進藻類的生長。而高濃度的硒添加對藻類生長產生抑制作用即為毒性效應，其根本原因是微量元素硒的補充過量。具體表現，一是硒與葉綠素結合，干擾光合作用中的電子傳遞，導致細胞內營養物供應不足[18]；二是硒替代硫元素的活動，影響蛋白的結構，從而影響生命活動的正常進行[19]。

肖俊超等研究發現，在20 mg/L硒脅迫下210 h后小球藻開始進入衰亡階段，產生毒性效應[20]；劉少華等研究顯示，25 mg/L的硒添加就會對藻體產生明顯的抑制效果[21]。而本研究表1、圖1表明，在亞硒酸鈉濃度范圍(0～100 mg/L)，其中硒含量最高約為45.7 mg/L，對蛋白核小球藻的生長并沒有產生顯著的促進或抑制作用，推測小球藻可承受高于45.7 mg/L硒濃度。造成這種差異的原因可能是由于硒源、藻種、光照周期以及培養介質等條件的差異所致。此外，本研究中硒源的添加方式(直接暴露或通過食物鏈傳遞)也會對藻細胞的生長產生不同影響[22]。硒對小球藻影響可能還與藻的濃度有關，藻類密度達到一定程度時，其對硒的耐受性顯著增加，藻的單位濃度不同，其遭遇的硒脅迫強度就有差異。

一般而言，在低硒濃度范圍內，藻的富硒能力隨硒濃度提高而增大，而高濃度范圍內，隨硒濃度增加，富硒量下降，過高或過低的硒添加量都不利于藻對硒的生物富集。本研究含硒量測試結果顯示，蛋白核小球藻在硒濃度約為4.57～36.60 mg/L 具有高效富集效應，而0.00～4.57 mg/L和36.6～45.7 mg/L分別代表了偏低和偏高的硒濃度范圍。在此之前，人們也探究過普通小球藻的富硒能力，在其最適硒添加濃度(4～8 mg/L)時含硒量達到80.13 、83.66 mg/kg，分別是未添加硒的728、761倍[4]。這與本研究雖有差異，但也有相似之處。

3.2　無機硒和富硒藻對萼花臂尾輪蟲種群增長的影響

輪蟲在水產養殖中作為魚類育苗的活餌料被廣泛應用，其批量生產大多依靠單細胞藻類或酵母。輪蟲由于微量元素、脂質、蛋白質等營養物質缺陷而導致育苗成活率較低，也是制約水產養殖行業魚苗育種一個難題。學者們在這方面做出了廣泛探究，Matsumoto等就對鋅元素做了相關研究，發現輪蟲不能直接吸收培養基中的無機鋅源，可以以微藻為載體富集于藻體內，通過食物鏈傳入輪蟲體內，輪蟲體內富集鋅可高達到585 mg/kg[23]。周竹君等對鋅和鈷元素的研究認為促進褶皺臂尾輪蟲增殖的鋅、鈷適宜濃度分別為0.4、4.0 mg/L[24]。

由本研究可見，在低濃度硒范圍內(0.02～0.18 mg/L)，補硒均能促進輪蟲的種群增長，最大增長率出現在硒含量約0.09 mg/L。在正常的水體中[2]可滿足萼花臂尾輪蟲的需要。Kim等探究富硒后的普通小球藻對褶皺臂尾輪蟲種群動態的影響效應發現，富硒藻組培養的輪蟲雖然在種群增長率和最高種群密度方面無明顯差異(種群增長率為0.61±0.01，最高種群密度為753.7±218.0 ind/mL)，但輪蟲種群的混交率、受精率和休眠卵產量均發生顯著變化，影響輪蟲的有性生殖過程[34]。在富硒小球藻的試驗中，筆者發現低濃度硒添加組(硒含量約為0.02～0.18 mg/L)培養的富硒小球藻對輪蟲生長產生明顯抑制作用，而且在試驗過程中未出現有性生殖的發生。究其可能的原因是富硒小球藻含硒量超過輪蟲的安全濃度，而且輪蟲對有機硒的利用率遠高于無機硒，喂食富硒小球藻的輪蟲體內累積過多的硒，改變了其蛋白質結構，影響了細胞正常的生命活動。另外培養出混合營養豐富度高的小球藻對輪蟲的營養強化或許能達到“1+1>2”效應，這也將是我們今后探究的方向。

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