鎘污染對文冠果土壤微生物的影響

江　偉， 于小飛， 田永蘭， 柴　陽， 熊元武， 鐘　馨， 張化永

(華北電力大學工程生態學與非線性科學研究中心，北京 102206)

土壤重金屬污染已經成為一個世界性問題，在當代科學領域備受關注[1-2]。據報道，由于工業廢水不合理排放、農業化學藥品不合理使用、含鎘磷肥的使用以及汽車尾氣排放等，我國農業主產區土壤中的鎘含量已經有明顯的積累現象[3]。鎘污染對我國農業生產有重要影響，首先，農作物從受污染土地中吸收鎘，農作物生長發育受到抑制，產量大幅降低[4]。其次，土壤鎘污染也會使農產品中的重金屬鎘含量超標，而使植物蛋白質、葉綠素、糖、維生素C等含量降低[5]。因此，如何有效地處理土壤中的鎘污染，已經成為近年來環境保護領域的突出問題。

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)屬于無患子科文冠果屬，落葉小喬木，適應性強，在草沙地、撂荒地、多石的山區、黃土丘陵和溝壑等處，甚至在崖畔上都能正常生長發育。在我國的分布范圍為8°37′～47°20′N、73°20′～120°25′E，遍布華北、華東及西北地區。其種子含油率高達74%，由文冠果籽油制備的生物柴油相關烴脂類成分含量高，內含18C的烴類占93.4%，且無硫、氮等因子污染環境，符合現行的優質生物柴油指標，是北方理想的木本油料樹種[6]。

針對鎘污染日益嚴重的現狀，植物修復技術成為一種新型的、低成本的、環境友好的解決土壤鎘污染問題的手段，尤其適合發展中國家。利用文冠果來修復重金屬鎘污染土壤，再將收獲的文冠果果實用于生物柴油的生產，既可以改善環境質量，又可以實現資源化。有研究表明，文冠果對鎘污染具有較高的耐受性，其生長過程中的株高、莖粗、生物量等僅在土壤中鎘達到200 mg/kg時才受到顯著抑制[7]。截至目前，對文冠果生長過程中土壤微生物的變化與重金屬之間關系的研究尚未見報道，而文冠果種植地區的土壤污染卻不容忽視，其在生物能源產出和土壤污染修復方面的作用會在未來能源環境領域逐漸凸顯。

本研究采用溫室盆栽試驗，通過長期試驗，考察不同生長期下的文冠果土壤微生物對重金屬鎘的響應，采用Biolog Eco微平板研究人工污染土壤中外源鎘不同濃度對土壤微生物活性與功能多樣性的影響，以期為實現能源木本植物修復鎘污染土壤提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

本試驗選取的文冠果購自河南省洛陽市嵩縣綠源綠化種苗科研有限公司。

供試土壤采自北京農學院試驗田，土壤為黃褐土。取0～20 cm表層土壤，新鮮土樣去除植物殘體、礫石等，自然風干，過2 mm篩備用，土壤基本理化性質見表1。

表1　土壤基本理化性質

1.2　試驗設計

試驗設置4個鎘濃度梯度：0、10、50、100 mg/kg(以純鎘計)，文冠果種子經浸泡發芽后移栽到裝有7 kg含有不同濃度的鎘污染土壤的花盆中，每盆定苗2株，每個處理3個重復，溫室中培養，整個生長過程用自來水澆灌以維持田間持水量約為60%。盆栽試驗于2009年5月中旬開始，在2009年7月19日、2009年9月14日、2009年11月12日等3個生長期時間點取樣。樣品采集時，在距植株主干8 cm處挖取2個直徑為2.5 cm、深12 cm的土樣，混合組成樣品。采集的新鮮土樣過2 mm網篩，一部分土樣放在4 ℃冰箱保存，供微生物指標分析；另一部分土樣自然風干，供土壤基本理化性狀測定。

1.3　測定方法

1.3.1土壤微生物群落功能多樣性分析本試驗采用Shannon指數(H)和Gini系數(G)反映不同處理下土壤微生物多樣性的差異。Shannon指數是反映群落豐富度和分布均勻程度的綜合指標，是目前應用最為廣泛的群落多樣性指數之一。Gini系數表示微生物的均勻度，G介于0～1之間，當G=0時表示微生物群落分布絕對均勻，當G=1時表示微生物群落分布絕對不均勻。

1.3.2Biolog Eco微平板本研究中功能多樣性的測定采用基于Biolog Eco微平板的碳素利用法，具體操作過程如下：將Biolog Eco微平板從冰箱內取出，25 ℃預熱15 min。稱取相當于5 g烘干土壤質量的新鮮土樣，加入內有45 mL 0.85% NaCl溶液(質量濃度)的三角瓶中，用8層紗布封口，在 200 r/min 搖床中振蕩30 min。手搖數秒后，迅速用滅菌的吸管吸取1 mL土壤懸液，加入內有9 mL 0.85% NaCl溶液的試管中，手搖數秒后，迅速用滅菌的吸管吸取2 mL土壤懸液，加入內有18 mL 0.85% NaCl溶液的試管中得到10-3稀釋液。用自動多頭移液器接種，接種量為150 μL/孔。將接種好的測試板加蓋在25 ℃下保濕暗培養10 d，每隔12 h用Biolog自動讀數裝置在590 nm下測定吸光度[8]。

平均顏色變化率[9](average well color development，簡稱AWCD)的表達式為AWCD=[∑(Ci-R)]/31，其中Ci是除對照孔外所測得31個反應孔的吸光度，R是對照孔的吸光度。

1.4　數據分析

為了避免接種密度帶來的差異，本研究運用AWCD接近0.6時的數據計算多樣性指數，進行主成分分析。試驗數據采用Microsoft Excel 2007處理，相關性分析、方差分析以及主成分分析等多元統計分析采用軟件SPSS 16.0及Matlab 7.0實現。本試驗中，對數據先進行泰勒轉換或對數轉換，再進行主成分分析。

2　結果與分析

2.1　鎘污染對文冠果土壤微生物活性的影響

土壤微生物接種到Biolog Eco微平板后，微生物利用板中的碳源使指示劑變色，隨著碳源消耗量的增加指示劑顏色加深，從而相應碳源的吸光度增大。AWCD表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個重要指標，反映了土壤微生物的整體活性。

AWCD的變化曲線分3個變化階段，滯后期、對數增長期和穩定期。由圖1可知，在文冠果的第1生長期(或拔節期)，與空白對照相比，10 mg/kg鎘對土壤微生物群落總體活性影響不大，50、100 mg/kg鎘使土壤微生物活性降低。在第2生長期，10 mg/kg鎘使微生物活性明顯增加，而50、100 mg/kg 鎘對其影響不大。在第3生長期，各處理組表現出與第1生長期相似的趨勢。

生長期對微生物的活性也有一定的影響，隨著生長時間的延長，空白對照及50、100 mg/kg鎘處理中土壤微生物的活性變化趨勢均表現為先下降后上升，10 mg/kg鎘處理的趨勢與之相反，表現為先上升后下降。鎘污染濃度為10 mg/kg時，第2生長期的AWCD最高，而其他處理則表現為第1生長期的AWCD最高，第2生長期的AWCD低于其他2個生長期。

2.2　鎘污染對文冠果土壤微生物多樣性的影響

從表2可以看出，在文冠果的整個生長過程中，當鎘的濃度為100 mg/kg時，Shannon指數(土壤微生物的豐富度、均勻度)最高，方差分析結果表明，這種差異并不顯著。對文冠果Gini指數(土壤微生物活性)的分析發現，在第2生長期，當鎘的濃度為10 mg/kg時，土壤微生物活性最高，而此時微生物的豐富度、均勻度最低，表明在該濃度鎘污染下，微生物的群落結構發生了改變，鎘耐性微生物成為優勢種，鎘敏感微生物種群降低。

表2　不同處理下文冠果土壤微生物功能多樣性指數

注：表中數據為3個樣品的平均值。每列數據后不同大寫字母、每行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　鎘污染對文冠果土壤微生物代謝圖譜的影響

由圖2-A可知，應用主成分分析法在31個主成分中提取的2個主成分因子，分別可以解釋原變量特征的26.84%、25.27%。用第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)作圖表征文冠果第1生長期土壤中微生物的代謝特征。主成分得分系數的方差分析結果表明，PC1得分系數差異顯著(F3，8=6.196，P=0.018<0.05)。這種差異主要表現在圖2-A中 100 mg/kg 鎘處理的微生物群落落在PC1正方向，對照、10 mg/kg 鎘處理的微生物群落位于PC1的負方向，50 mg/kg鎘處理的微生物群落居中，說明100 mg/kg鎘處理與對照及10 mg/kg鎘處理差異顯著。通過主成分分析發現，D-纖維二糖、α-D-乳糖、i-赤蘚糖醇、D，L-α-磷酸甘油、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等與PC1正相關，衣康酸、丙酮酸甲酯、L-天門冬酰胺、吐溫-80等與PC1負相關。

文冠果第2生長期土壤中微生物的代謝特征見圖2-B，得分系數的方差分析結果表明，PC1得分系數差異極顯著(F3，8=12.556，P=0.002<0.01)。這種差異主要表現在圖2-B中10 mg/kg鎘處理的微生物群落落在PC1負方向，對照及50 mg/kg鎘處理的微生物群落位于PC1的正方向，說明10 mg/kg鎘處理與對照及50 mg/kg鎘處理之間差異極顯著，而對照及50、100 mg/kg鎘處理之間并無顯著性差異，以上結果表明與空白對照相比，高濃度的鎘污染并沒有改變微生物群落碳源利用的功能多樣性，證明文冠果土壤微生物對鎘污染具有一定的耐受性，在鎘污染條件下仍可以保持特定的活性能力。通過主成分分析發現，α-D-乳糖、D-木糖/戊醛糖、i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-葡糖胺酸、L-絲氨酸等與PC1正相關，說明10 mg/kg鎘濃度的土壤中，微生物降低了對上述碳源的利用率。而衣康酸、糖苷與PC1負相關，表明10 mg/kg鎘濃度的土壤中，微生物增加了對這些碳源的利用率。

文冠果第3生長期土壤中微生物的代謝特征見圖2-C，PC1、PC2得分系數的方差分析結果表明，各處理之間得分系數差異不顯著(PC1：F3，8=2.197，P=0.166>0.05，PC2：F3，8=0.328，P=0.810>0.05)。說明在第3生長期土壤微生物群落沒有顯著變化，這與AWCD變化一致，這可能是由于交換態鎘會隨時間的延續而逐漸減小所造成的。

3　結論與討論

微生物是土壤中生物量最大、種類最豐富的類群，對于重金屬污染，土壤微生物與其直接接觸、關系密切，與植物相比微生物對污染物的反應更加靈敏。曾路生等在水稻盆栽條件下，添加外源鎘，發現鎘濃度較低時，土壤微生物量碳和氮與鎘濃度呈正相關關系，而較高的鎘濃度使二者呈負相關關系，鎘濃度的轉折點因土壤性質有所差異[10]。本試驗中發現的當鎘濃度為 10 mg/kg 時可以提高微生物的生物量，增加微生物代謝活性的結論與之相一致。本研究中，高濃度的鎘污染對文冠果土壤微生物的影響不大，說明文冠果對重金屬鎘具有一定的耐受性。隨著生長期的延長，在第3生長期，鎘污染對文冠果土壤微生物的影響有減弱的趨勢，主要是由于重金屬元素在土壤中的活性或有效性會隨其存在的時間發生變化，交換態鎘會隨時間的延續而逐漸減小[11]。Ipsilantis等通過盆栽試驗對高濃度鉻污染下芥菜根際微生物群落進行研究，4周后，土壤中鉻的有效態明顯降低，微生物的多樣性提高，可能是由于重金屬使優勢種的優勢度降低，從而消除了優勢種對其他物種的競爭抑制作用，使微生物的多樣性有所提高[12]。本研究中發現的鎘濃度為100 mg/kg時微生物豐富度、均勻度最高，而鎘濃度為10 mg/kg時微生物豐富度、均勻度最低這一結論與之相似。另外，段學軍等采用現代分子生物學技術，探討重金屬鎘污染條件下稻田土壤微生物種群的基因多樣性，證明低濃度鎘對某些微生物類群具有一定的刺激作用，個別種群對鎘脅迫較為敏感，種群數量大大降低[13]。

環境微生物研究中，Biolog Eco微平板由于操作簡單得到廣泛應用，且這種方法能夠獲得豐富的數據，從而能直觀反映微生物種群的整體活性。彭芳芳等利用Biolog Eco微平板技術探索鈾污染與土壤微生物群落結構和功能的關系，通過計算各樣品的AWCD、Shannon指數和Simpson指數等來指示微生物的結構和功能變化，得到最終結論，不同濃度的鈾污染會使土壤微生物的AWCD降低37.6%～92.0%[14]。對Biolog Eco數值進行主成分分析發現，土壤微生物群落代謝多樣性表現出差異的主要碳源為碳水化合物類，其次是氨基酸類以及胺類[14]。目前，關于這些大分子與微生物之間的相互調節作用，國內主要利用Biolog Eco微平板試驗，但須要新的方法、新的思路補充進來以便更深入地研究。魯順保等引用國外的MicroResp方法研究了澳大利亞3種類型森林(濕地松、南洋杉、貝殼杉)土壤微生物的功能多樣性，結果發現土壤pH值對微生物利用L-丙氨酸、精氨酸、D-(+)-葡萄糖、N-乙酰基-氨基葡萄糖的影響較大，這些類群的微生物主要分布在貝殼杉林地；分布在南洋杉林地的微生物對檸檬酸、L-蘋果酸和γ-酪氨酸的利用率較大，且主要是受總磷含量的影響；D-(+)-果糖、檸檬酸和L-半胱氨酸-鹽酸等受水分、總氮含量、總碳含量等的影響較大，這類微生物類群主要分布在濕地松林地[15]。MicroResp方法結合了Biolog和底物誘導呼吸2種方法的優點，可以研究整個土壤中微生物的代謝功能，且耗費低、研究周期短[16]，可以作為將來試驗設計的一種參考。另一方面，為了了解鎘等重金屬污染與微生物群落結構變化之間的關系，可以深入利用分子生物學技術研究微生物群落組成[17-18]。微生物代謝周期較短，從遺傳學或進化學角度考慮，微生物群落結構變化過程是一個優勝劣汰的過程，鎘添加過程作為外界刺激會造成微生物遺傳信息的變化，更深一步，可以考慮從基因、蛋白質組學或基因組學角度來解釋這種變化發生的根本原因[19]。

本研究利用主成分分析法研究了鎘添加條件下微生物對碳源利用的變化，可以從側面反映微生物群落變化和微生物活性變化，例如，在第1生長期內，100 mg/kg鎘促進了以D-纖維二糖、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等為營養的微生物的生存，而抑制了以衣康酸和糖苷為碳源的微生物的存活。從圖1和表2來看，鎘添加對微生物活性的影響在第2生長周期表現的最明顯，土壤微生物活性升高，多樣性降低，利用碳水化合物的土壤微生物種群降低，能利用多聚物的微生物種群增加。這很可能是重金屬鎘的選擇性所致，利用碳水化合物的微生物對鎘敏感，在鎘的作用下種群數降低；能利用衣康酸、肝糖的微生物對重金屬鎘有耐受性，種群數升高。Roane等通過DNA分析，檢測鎘污染及無污染土壤中的微生物組成，結果發現，鎘污染的土壤中可培養的微生物數量減少，但能分離出抗性微生物[20]。鎘耐性微生物成為優勢種，鎘敏感微生物種群降低，因此文冠果第2周期應該是對鎘添加最敏感的時期，在今后研究鎘對文冠果土壤微生物影響時應格外關注。

參考文獻：

[1]Rajkumar M，Sandhya S，Prasad M N V，et al. Perspectives of plant-associated microbes in heavy metal phytoremediation[J]. Biotechnology Advances，2012，30(6)：1562-1574.

[2]Ali H，Khan E，Sajad M A. Phytoremediation of heavy metals—concepts and applications.[J]. Chemosphere，2013，91(7)：869-881.

[3]曾希柏，徐建明，黃巧云，等. 中國農田重金屬問題的若干思考[J]. 土壤學報，2013，50(1)：186-194.

[4]吳鵬，周青. 鎘與酸雨交叉脅迫對大豆種子萌發過程中膜脂過氧化的影響[J]. 中國生態農業學報，2010，18(5)：1145-1147.

[5]謝建治，張書廷，劉樹慶，等. 潮褐土重金屬Cd污染對小白菜營養品質指標的影響[J]. 農業環境科學學報，2004，23(4)：678-682.

[6]敖妍，段劼，于海燕，等. 文冠果研究進展[J]. 中國農業大學學報，2012，17(6)：197-203.

[7]于學靜. 污染元素鎘對能源植物文冠果和荊條生長的影響[D]. 北京：華北電力大學，2010：23-35.

[8]區余端，蘇志堯，彭桂香，等. 車八嶺山地常綠闊葉林冰災后土壤微生物群落功能多樣性[J]. 生態學報，2009，29(11)：6156-6164.

[9]安韶山，李國輝，陳利頂. 寧南山區典型植物根際與非根際土壤微生物功能多樣性[J]. 生態學報，2011，31(18)：5225-5234.

[10]曾路生，廖敏，黃昌勇，等. 鎘污染對水稻土微生物量、酶活性及水稻生理指標的影響[J]. 應用生態學報，2005，16(11)：2162-2167.

[11]Wong S C，Li X D，Zhang G，et al. Heavy metals in agricultural soils of the Pearl River Delta，South China.[J]. Environmental Pollution，2002，119(1)：33-44.

[12]Ipsilantis I，Coyne M S. Soil microbial community response to hexavalent chromium in planted and unplanted soil[J]. Journal of Environmental Quality，2007，36(3)：638-45.

[13]段學軍，閔航. 鎘脅迫下稻田土壤微生物基因多樣性的DGGE分子指紋分析[J]. 環境科學，2004，25(5)：122-126.

[14]彭芳芳，羅學剛，王麗超，等. 鈾尾礦周邊污染土壤微生物群落結構與功能研究[J]. 農業環境科學學報，2013(11)：2192-2198.

[15]魯順保，郭曉敏，芮亦超，等. 澳大利亞亞熱帶不同森林土壤微生物群落對碳源的利用[J]. 生態學報，2012，32(9)：2819-2826.

[16]Yan W，Rebekkare A，David J. Species-specific effects of plants colonising cutover peatlands on patterns of carbon source utilisation by soil microorganisms[J]. Soil Biology & Biochemistry，2008，40(2)：544-549.

[17]Su H J，Luo L，Wang S J，et al. Semi-continuous anaerobic digestion for biogas production：influence of ammonium acetate supplement and structure of the microbial community[J]. Biotechnology for Biofuels，2015，8(1)：1-11.

[18]劉紹雄，王明月，王娟，等. 基于PCR-DGGE技術的劍湖濕地湖濱帶土壤微生物群落結構多樣性分析[J]. 農業環境科學學報，2013，32(7)：1405-1412.

[19]Tripathi B M，Song W，Slik J W F，et al. Distinctive tropical forest variants have unique soil microbial communities，but not always low microbial diversity[J]. Frontiers in Microbiology，2016，7(165)：376.

[20]Roane T M，Pepper I L. Microbial responses to environmentally toxic cadmium[J]. Microbial Ecology，1999，38(4)：358-364.