中緬樹鼩自然感染五種高致病性人腺病毒的血清流行病學分析

　，，，，　

人腺病毒于1953年首次從手術切除的兒童腺體和扁桃體內分離、鑒定，可感染呼吸道、泌尿生殖道及眼角結膜等多種粘膜組織，引起多種疾病甚至死亡[1]。目前腺病毒已有A-G共7種68個腺病毒型別。其中B組人3、7、11、14、55和E組4型腺病毒是引起重癥致死性肺炎的主要病原體[2]。由于人腺病毒具有嚴格的宿主專一性，在常用的模型動物體內并不感染和復制，目前國內外仍無其疾病動物模型，因此人B組腺病毒感染相關的致病機制，尤其是致重癥機制，以及不同型病毒間的重組機制等仍不清楚，亟待研究。

中緬樹鼩屬哺乳綱，有胎盤類，攀鼩目，樹鼩科，我國云南、廣西、廣東、海南島均有分布。樹鼩與靈長類親緣關系接近，其解剖結構、生化代謝及基因組方面與人具有較高的相似度，遠高于鼠、犬、豬等常用實驗動物，因此被認為是靈長類最親密的近親[3]。中國對樹鼩的研究早見于教研學和動物學方面，1975年首先進行醫學上的嘗試，用于代替恒河猴作為小兒麻痹方面的實驗。近年來，昆明動物研究所對樹鼩進行了全基因組測定和解析工作，為樹鼩應用于醫學生物學方面提供了理論依據[4]。陳元鼎等人從樹鼩糞便中檢出具有低滴度的凝聚人O型、B型紅細胞的腺病毒，但至今仍未確定樹鼩易感人源腺病毒[5]。鑒于樹鼩已證實可感染多種人源病毒，如多種肝炎、輪狀、皰疹、棒狀、副粘[6-8]，而且人腺病毒研究正困于缺乏合適的動物模型，將樹鼩應用于人腺病毒動物模型的建立是一個良好的研究方向。

為了探討樹鼩存在自然感染人腺病毒的可能性及分型，本實驗測定樹鼩血清對B組人Ad3、Ad7、Ad14、Ad55和E組人Ad4的中和效價水平，進而為后續探索人腺病毒的樹鼩動物實驗模型的建立提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及標本采集樹鼩購于昆明醫科大學實驗動物中心，雌雄各半，年齡均>6月齡，于P2動物實驗室恢復性飼養1周后進行實驗。于樹鼩腿靜脈處采集0.5 mL無抗凝血，采集后對待測血液標本編號，共34份樣本。將血液標本在4 ℃冰箱內靜置1 h，3 500 r/min離心5 min，收集血清，-80 ℃保存。

1.2病毒和細胞系人293細胞系為本實驗室保存。實驗中使用的人腺病毒Ad3(GenBank：DQ099432)、Ad4(GenBank：KF006344)為本實驗室分離和保存；Ad7(GenBank：JX625134.1)為重慶醫科大學附屬兒童醫院惠贈；Ad14(GenBank：JQ824845.1)為南方醫科大學張其威教授惠贈；Ad55(GenBank：KF911353.1)為中國科學院生物醫藥與健康研究院陳凌研究員惠贈。病毒在293細胞增殖，并經氯化銫密度梯度離心法純化，測定TCID50，-80 ℃保存。

1.3試劑PBS、DMEM培養基、胎牛血清、100×細胞培養用青霉素、鏈霉素、0.25%含EDTA胰酶購自GIBCO公司。42.23%和22.39%氯化銫溶液(pH=8.0)為自行配置。

1.4實驗方法

1.4.1病毒微量血清中和試驗參照中華人民共和國衛生行業標準(WS214-2008，附錄B：微量中和試驗操作步驟)和相關文獻[9-11]，采用固定病毒稀釋血清的方法進行。待測血清標本56 ℃滅活30 min，以除去可能存在的非特異反應物。滅活后血清標本40 μL用DMEM從1∶16開始作倍比稀釋(從24-210)，即所產生的稀釋倍數為1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024。根據所測滴度，用病毒維持液(含2%血清的DMEM)將病毒稀釋為200 TCID50。取稀釋好的待測血清及陽性血清與病毒稀釋液等量混合(病毒稀釋液終濃度為100 TCID50)。設定細胞對照、病毒對照組，將陰性對照混合液、陽性對照病毒混合液、血清對照混合液、待測血清病毒混合液及病毒工作滴度檢查混合液置于37 ℃水浴作用1 h。最后接種至前1 d預先鋪滿239細胞的96孔培養板中，置37 ℃、5% CO2濕溫培養箱孵育l h，棄去接種物，加入細胞維持液繼續培養，培養3 d后，于顯微鏡下觀察細胞病變，讀取結果。

以病毒對照組為對照，待檢樣品可保護50%細胞的為陽性樣品，其保護50%細胞的最高稀釋度為該樣品的中和效價。

1.4.2數據處理計數資料統計描述給出頻數和百分比。SPSS 19.0進行統計分析，Fisher確切概率法檢驗血清中和抗體等級分布，P≤0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.15種腺病毒血清抗體陽性樹鼩情況中和抗體出現于病毒感染的較早期，在體內的維持時間較長，動物體內中和抗體水平的高低，可顯示動物抵抗病毒的能力，作為判斷動物是否感染過該種病毒的指標。結果顯示，共有21份樹鼩血清對5種主要流行的人腺病毒中的一種或多種具有中和作用，發揮保護細胞的作用，其中Ad14中和抗體的檢出陽性率最高，為55.88%(19/34)，Ad3和Ad55的陽性率也較高，分別為47.06%(16/34)和29.71%(10/34)，見表1。21份陽性樣品中，有6份為單價抗血清，14份為多價血清，見表2。

2.2樹鼩抗血清樣本中和效價水平21份樹鼩陽性抗血清根據抗體種類及水平排序，見表3。陽性血清主要表現為Ad3、Ad14和Ad55的混合型多價抗血清。Fisher確切概率法檢驗血清中5種型別的中和抗體水平具有統計學差異(P≤0.05)，其中Ad3與Ad4、Ad4與Ad14、Ad7與Ad14的中和效價等級構成具有統計學差異(P≤0.005)，中和Ad3與Ad14的抗血清效價較高，見圖1。

表1樹鼩抗血清中不同型別人腺病毒中和抗體陽性率
Tab.1Positive rate of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera

病毒型別Virustype陽性數(份)Samplesize陽性率(%)PositiverateAd31647．06Ad438．82Ad7514．71Ad141955．88Ad551029．71

表2樹鼩中不同血清型中和抗體混合情況
Tab.2Mixture of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera

中和抗體混合種類Numberofmixtures例數Samplesize百分比(%)Percentage01338．241617．652514．713411．764514．71512．94

表321份樹鼩陽性抗血清樣本的中和效價(1∶χ)
Tab.3Neutralizing titer of 21 positive serum samples

No．Ad3Ad4Ad7Ad14Ad55110246464256128251216-128323102432-32324256-12832325512-16128326128-16326471024--128328256--322569128--64321032--16161132--16-1232--16-1332--16-1432--64-1532--16-16128----17--16--18---16-19---16-20---16-21---16-

圖1　不同型別的血清中和效價分布Fig.1　Neutralizing titer statistics of positivesamples

3　討　論

有研究報道以棉鼠、倉鼠、CBA小鼠、FVB/n小鼠為實驗動物建立人腺病毒感染動物模型，但大部分是基于人5型腺病毒的研究，很少見其它型別的人腺病毒感染動物模型研究報道[9-13]。人5型腺病毒大劑量時可以感染這些動物模型并引起肺炎，但多表現出自限性，病毒在幾天內即被清除干凈。相對于人5型、2型等C組腺病毒感染，人3型、7型、11型等B組腺病毒感染常導致更嚴重的肺炎，也可能并發心肌炎、腎炎等[14]。因為3、7型等B組腺病毒感染的受體(橋粒芯蛋白-2，DSG-2)與5型腺病毒(CAR)不同，具有不同的組織嗜性[15]，所以這些用于人5型腺病毒研究的動物模型可能不適合其它型別腺病毒感染研究，人3型、7型、11型、21型、55型等相關型別的腺病毒感染動物模型還需要系統性的研究。本研究小組前期也利用人3型、4型和55型腺病毒對小鼠、裸鼠、金黃地鼠等嚙齒類動物進行了攻毒實驗，發現病毒并不在細胞中復制增殖，感染動物后呈一過性感染，動物無明顯癥狀表現，表明上述動物不適合作為人B組腺病毒的感染動物模型。

樹鼩作為一種新型的實驗動物，在當今醫學生物學(特別是病毒學)研究中發揮了越來越重要的作用。韓建保等人用酶聯免疫法檢測272份樹鼩血清中人腺病毒IgG抗體，結果無陽性樣品[16]。在本研究中，我們采用微量中和實驗的方法來測定樹鼩血清中的人腺病毒抗體，該方法是檢測宿主過往感染史的經典方法，與常用的酶聯免疫法等檢測方法相比更具有優勢：1)特異性更強，不存在交叉反應。微量中和實驗法檢測血清中的抗人腺病毒中和抗體，是目前仍在沿用的腺病毒血清型分型法的標準方法，各型別之間無交叉中和反應；而ELISA法檢測對象是血清中存在的多克隆抗體，在動物腺病毒和人腺病毒之間可能存在交叉反應，影響結果的特異性。2)準確性更高，可用于病毒分型，明確樹鼩過往感染的人腺病毒型別，并可進一步明確同一動物多次感染不同型別病毒的感染史。

本實驗對34份樹鼩抗血清樣本進行5種腺病毒的中和試驗，結果顯示21份樣本顯陽性，樹鼩血清大部分為多價抗血清，主要表現為和Ad3、Ad14和Ad55混合型多價抗血清。我國時有B組人腺病毒疫情暴發，血清型以3、7型為主，而新發致急性呼吸道疾病的14型和55型自首次暴發后每年均有新增個案，且疾病程度嚴重[2,11,17-24]。主要流行型Ad3和近年來在人群中新發的Ad14和在樹鼩血清中的中和抗體檢出率和效價較Ad55和Ad7的高，E組Ad4的陽性率和中和效價較低，提示人腺病毒在樹鼩中的流行情況與在人群中暴發情況有著相關性。樹鼩種群中存在人腺病毒流行，是潛在的人腺病毒動物模型候選，以樹鼩為實驗動物建立人腺病毒感染模型具有較大的可能，后續可深入探討。

參考文獻:

[1] Hilleman MR，Werner JH．Recovery of new agent from patients with acute respiratory illness[J].Proc Soc Exp Biol Med,1954,85(1)：183-188．

[2] Xie L,Yang XH,Chen EF,et al．Research progress of Adenovirus Infection[J].Prew Med,2015,27(3)：262-265．(in Chinese)

謝立，楊旭輝，陳恩富．腺病毒感染研究進展[J]．預防醫學，2015，27(3)：262-265．

[3] Xu L,Zhang Y,Liang B,et al．Tree shrews under the spot light: emerging model of human diseases[J].Zoological Res,2013,34(2)：59-69．(in Chinese)

徐林,張云,梁斌,等．實驗動物樹鼩和人類疾病的樹鼩模型研究概述[J].動物學研究，2013，34(2)：59-69．

[4] Fan Y,Huang ZY,Cao CC,et al．Genome of the Chinese tree shrew[J]．Nat Communicat，2013，4：1426．DOI：10.1038/ncomms2416

[5] Chen YD,Dai GZ,Li J,et al．Study on adenoviruses in tree shrew stools[J]．Chin J Zoonoses，1987，3(3)：2-4．(in Chinese)

陳元鼎,戴國珍,李軍,等.樹鼩大便中腺病毒的實驗研究[J].中國人獸共患病雜志,1987,3(3)：2-4．

[6] Li Y,Su JJ,Yang C，et al．Progress on establishment of tree shrew (Tupaia) chronic infection with HBVinvivo[J].Zoological Res,2011,32(1)：104-108．(in Chinese)

李瑗，蘇建家，楊春，等．乙型肝炎病毒樹鼩體內慢性感染模型的研究歷程和展望[J]．動物學研究，2011,32(1):104-108．

[7] Yin AG,Kuang DX,Li XF,et al．Progress in application of tree shrew models in research on human viral diseases[J].Acta Lab Anim Sci Sin，2014，2(22)：86-89．(in Chinese)

殷安國，匡德宣，李曉飛，等．樹鼩模型在人類病毒性疾病研究中的應用進展[J]．中國實驗動物學報，2014，2(22)：86-89．

[8] Liang L,Li Y,Yang C,et al．Preliminary study of using the artificially fed and young tree shrews as the infection model for human Hepatitis B virus[J]．Chin J Zoonoses，2006,22(8)：792-795．(in Chinese)

梁亮,李瑗,楊春,等．用人工繁育的圍生期和幼年樹鼩感染人乙型肝炎病毒的初步研究[J].中國人獸共患病學報,2006,22(8)：792-795．

[9] Mao QY，He P，YuX，et al．Laboratoryevaluation of method for determination of neutralizingantibody against human enterovirus71[J]．Chin J Biologicals，2010，23(8)：885-888．

毛群穎，何鵬，于祥，等．人腸道病毒71型中和抗體檢測方法的實驗室評價[J]．中國生物制品學雜志，2010，23(8)：885-888.

[10] Yu B，ZhouY，Wu H，et al．Seroprevalence of neutralizing antibodies to human adenovirus type5 in healthy adults in China[J]．J Medical Virol,2012，84：1408-1414．DOI：10.1002/jmv.23325

[11] Zheng XH，RongX，Feng Y，et al．Seroprevalence of neutralizing antibodies against adenovirus type 14 and 55 in healthy adults in Southern China[J]．Emerg Microbes Infect，2017，6(6)：e43．DOI：10.1038/emi.2017.29

[12] Sharma A，Bangari DS，Tandon M，et al．Comparative analysis of vector biodistribution，persistence and gene expression following intravenous delivery of bovine，porcine and human adenoviral vectors in a mouse model[J]．Virology，2009，386(1)：44-54．DOI：10.1016/j.virol.2009.01.008

[13] Pacini DL，Dubovi EJ，Clyde WA Jr．A new animal model for human respiratory tract disease due to adenovirus[J]．Infect Dis，1984，150(1)：92-97．

[14] Ginsberg HS，Moldawer LL，Sehgal PB，et al．A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，1991，88(5)：1651-1655．

[15] Prince GA，Porter DD，Jenson AB，et al．Pathogenesis of adenovirus type 5 pneumonia in cotton rats (Sigmodonhispidus)[J]．Virol，1993，67(1)： 101-111．

[16] Jogler C，Hoffmann D，Theegarten D，et al．Replication properties of human adenovirusinvivoand in cultures of primary cells from different animal species[J]．J Virol，2006，80(7)：3549-3558．DOI：10.1128/JVI.80.7.3549-3558.2006

[17] Fu WY，Liu WM，Xu Z，et al．Clinical analysis of 148 cases of adenovirus type 3 and 7 causing pneumonia complicated with myocarditis[J]．J Practical Pediatrics，1990，5(3)：129-130．(in Chinese)

傅文永,劉為民,許忠,等．3、7型腺病毒肺炎合并心肌炎148例臨床分析[J].實用兒科雜志，1990,5(3)：129-130．

[18] Wang H,Li ZY,Liu Y,et al.Desmoglein 2 is a receptor for adenovirus serotypes 3，7，11 and 14[J]．Nat Med,2011,17(1)：96-104.DOI：10.1038/nm.2270

[19] Han JB,Zhang GH,Duan Y,et al.Sero-epidemiology of six viruses natural infection inTupaiabelangerichinensis[J] .Zoological Res,2011,32(1)：11-16.(in Chinese)

韓建保,張高紅,段勇,等.中緬樹鼩自然感染六種病毒的血清流行病學[J].動物學研究，2011，32(1)：11-16.

[20] Li YM.The prevalence,genetic and epidemiological analysis of human bocavirus (HBoV) and human adenovirus (HAdV) among children with severe acute respiratory infection (SARI)[M]．Beijing：Chinese Center for Disease Control and Prevention，2015：11-16.(in Chinese)

李亞敏.重癥急性呼吸道感染兒童中人博卡病毒和人腺病毒的分型檢測與分析[M].北京：中國疾病預防控制中心,2015：11-16.

[21] Lenaerts L,Naesens L.Antiviral therapy for adenovirus infections[J].Antiviral Res,2006,71(2/3)：172-180．DOI：10.1016/j.antiviral.2006.04.007

[22] Yu Z,Zeng Z,Zhang J,et al．Fatal community-acquired pneumonia in children caused by re-emergent human adenovirus 7d associated with higher severity of illness and fatality rate[J].Sci Rep，2016，6：37216.DOI：10.1038/srep37216

[23] Chen Y,Liu FH,Wang CB,et al.Molecular identification and epidemiological features of human adenoviruses associated with acute respiratory infections in hospitalized children in southern China，2012-2013[J].Plos One,2016,11(5):e0155412.DOI：10.1371/journal.pone.0155412

[24] Li SL,Deng B,Yang HS,et al.Cause analysis and preventive measures of outbreak of adenovirus type 55 infection[J].J Pre Med Chin PLA，2015，33(2)：214．(in Chinese)

李森林,鄧兵,楊會鎖,等.55型腺病毒疫情暴發原因分析及防控對策[J]．解放軍預防醫學雜志，2015，33(2)：214．