木霉菌制劑防治藏紅花枯萎病研究

干華磊，蘇 鵬，葉乃瑋，王承芳，曠文峰，毛偉力

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木霉菌制劑防治藏紅花枯萎病研究

干華磊，蘇 鵬，葉乃瑋，王承芳，曠文峰，毛偉力*

（上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203）

將木霉（Spp）菌株TR121、TR358、TL09制成含2x108個/g孢子可濕性粉劑(WP)，用于防治藏紅花枯萎病的室內生測。結果顯示，經TL09 WP處理的藏紅花，枯萎病情指數(DS)顯著地低于（≤0.05）經TR121、TR358和化學藥劑75%百菌清以及清水對照處理的DS。將TL09 WP繼續用于2015和2016年防治藏紅花枯萎病的田間藥效試驗。經TL09 WP 1kg/畝（TR1）和2 kg/畝（TR2）處理的藏紅花，其DS和防治效果（ERDC）分別顯著地（≤0.05）低于或高于化學藥劑75%百菌清（TR3，僅在2015年）和空白處理（TR4）。同時，經TR1和TR2處理藏紅花的產量，也分別顯著地（≤0.05）高于TR3(僅在2015年)和TR4。

木霉菌；藏紅花；生物防治；防治效果

藏紅花(L)又稱番紅花、西紅花或撒馥蘭，屬鳶尾科番紅花屬多年生草本植物[1]?；ńz中含有活血化瘀、涼血解毒、安神健胃等功效的成分，有疏經活絡、消腫止痛、涼血解毒的作用，長期服用可提高人體的免疫力[2-3]。此外，藏紅花還可大量用于日用化工、食品、染料工業，是美容化妝品與香料制品的原料，其球莖可做作為觀賞花卉[4]。藏紅花的主產國是伊朗，我國藏紅花的主要種植基地在河南、浙江和上海崇明等地[5]。由于藏紅花的資源有限，產量低，導致價格昂貴，已被國家中醫藥管理局列為重點發展的中藥材品種[4]。

近年來，由于農田生態環境的不斷惡化和植物病原菌對多種化學藥劑的抗藥性不斷增強，枯萎病已成為對藏紅花生產影響最大的病害之一。在藏紅花種球儲存期和定植期，發病率可高達30%~70%，嚴重影響了球莖、柱頭的品質和產量，經濟損失巨大[6]。國內外學者曾先后對該病害的致病性病原菌作過報道[7-8]，依據形態學特征和分子學的鑒定方法，引起藏紅花枯萎病的病菌主要有尖孢鐮刀菌（)[9]、青霉菌（）、叢花青霉（）[10]和腐皮鐮刀菌（)[11]。目前對藏紅花枯萎病的防治主要采用化學藥劑，包括代森錳鋅、多菌靈、甲基托布津、多得清等[6,12]。但過多使用化學藥劑會導致病原菌產生抗藥性、農藥殘留和土壤、地下水污染等問題[13-15]。

為了減少和解決化學農藥所引起的諸多問題，越來越多的科研工作者和農業生物技術公司開發和利用微生物農藥產品，對多種作物病害開展生物防治[16-17]。郭榮君等[16]利用假單胞桿菌、芽孢桿菌等來防治大豆根腐病，防效達56.1%，增產7.6%；陳雪和趙克明[17]利用綠粘帚霉、鐮刀菌、木霉菌等防治棉花、水稻、小麥以及蔬菜等多種農作物上的根部病害并取得了很好的防治效果。積極地推廣和應用微生物農藥，不僅對環境安全，同時不易使病原菌產生抗藥性，是確保我國未來農業生產可持續發展行之有效的措施之一。但目前使用生物農藥防治藏紅花枯萎病的研究還不多見。本研究將篩選出的木霉菌株TL09制成可濕性粉劑，進行大田藏紅花枯萎病防治試驗，為生物防治藏紅花枯萎病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 木霉菌（spp）：菌株Tr85、Tr90、Tr121、Tr178B、Tr234C、Tr266B、Tr297A、Tr319、TR358、TL09，由上海萬力華生物科技有限公司（上海萬力華）提供。

病原菌：尖孢鐮刀菌(，FO16)，由上海萬力華從上海崇明島藏紅花種植基地的感病球莖中分離得到，并保存備用。

1.1.2 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA，Difco）。

麥麩培養基（WBM）：麥麩4L、土豆560g、葡萄糖56g、V8混合蔬菜汁200mL。

1.1.3 藏紅花苗和供試基地 藏紅花苗（美麗）和供試基地都由上海崇明建設鎮上海市藥材有限公司提供。

1.1.4 供試藥劑 75%百菌清WP（先正達蘇州作物保護有限公司）；TL09 WP (上海萬力華)。

1.2 試驗方法

1.2.1 平皿對峙試驗 采用平皿對峙培養法[18-20]，從保存在4 ℃恒溫冰箱里的FO16的平板上取直徑為5 mm的菌塊接種至PDA平板上，放置在培養箱中培養（25 ℃）5 d，在其菌落邊緣取5 mm的菌塊，置于PDA平板一側約2 cm處，取同樣大小的木霉（Tr85、Tr90、Tr121、Tr178B、Tr234C、Tr266B、Tr297A、Tr319、TR358、TL09）菌塊，置于平板對側相同位置。單個病原菌做空白對照，每組3個重復。將平板放置在培養箱中（25 ℃）進行培養，5d后計算抑菌率[21-22]。

抑菌率=（對照病原菌落直徑-處理病原菌落直徑）/對照病原菌落直徑×100%

1.2.2 室內生測篩選實驗 （1）固體病原菌接種體培養。從長有FO16菌落的PDA平板中，取直徑為10 mm的菌塊5~10塊，接種至裝有1 L WBM培養基的3L三角瓶內，放置在室溫條件下（25±2 ℃）培養10 d，然后將FO16接種體晾干，用粉碎機研磨成碎屑狀，按含有1×106個/g FO16活孢子的比例與細沙混合，制成沙土混合接種體。

（2）室內生測實驗。在藏紅花基地，取未發生過枯萎病區域的土壤，晾干后，用80目網過篩并裝入直徑為15 cm的營養缽中，每個營養缽裝入500g土和10 g混合接種體，混拌均勻后，將藏紅花苗移栽到營養缽內。實驗處理包括：Tr121、Tr358、TL09 各菌株的WP稀釋200倍，75%百菌清稀釋1 000倍，以及清水空白對照。每個處理藥劑分別對藏紅花苗進行灌根處理，每株灌藥水100mL。每個處理10缽，重復3次。苗缽放置在室溫條件下（25±2 ℃）生長，采用藏紅花常規種植的水肥管理。25 d后進行病情指數和防治效果調查。病情分級標準：0級：健全；1級：僅在葉片部小量失綠變黃或小斑點，病斑占整株的10%；3級：病斑部位占整株11%~25%；5級：病斑部位占整株26%~40%，且有呈現輕度矮化和扭曲癥；7級：病斑部位占整株41%~65%，有明顯矮化和扭曲癥，小部分葉片變褐枯；9級：病斑部位占整株65%以上，以至整株變褐枯或矮化、扭曲癥[23]。

病情指數=100×[Σ(各級病株數×病害級別數)]/(調查總株數×9)

防治效果=[(空白對照區施藥后病情指數－藥劑處理區施藥后病情指數)]/空白對照區施藥后病情指數]×100%

1.2.3 大田藥效試驗 2015和2016年大田藥效試驗的定植日分別為12月3日和12月2日。前茬種植作物為水稻，定植密度為20 000株/畝，采用藏紅花常規的水肥種植管理。實驗共設4個處理：TL09 WP 1 kg/畝（TR1）和2 kg/畝（TR2）、75%百菌清WP 200 g/畝（TR3）和空白對照（TR4）。每個處理3次重復，每個重復有2 000株苗，隨機排列。定植7 d后進行一次噴灌，隨后每隔20 d處理1次，共處理3次。

調查時間和方法：球莖收獲前一個月，以每小區對角線四點取樣, 每個點調查50株，進行病情指數調查；待球莖收獲時按同樣的方法取50株進行產量測定。病情分級標準、病情指數、防治效果的測定同上。

試驗數據用鄧肯新復極差法進行統計分析。

2 結 果

2.1 平皿對峙實驗

通過5 d的平皿對峙試驗，木霉菌株TL09、TR121、TR358可以有效的抑制FO16的生長，并將FO16覆蓋（見圖1-A）。同時TL09、TR121、TR358對FO16的生長抑制率都顯著地（≤0.05）高于其他菌株（表1），分別達到83.74%、73.17%、78.05%，因此，選擇此3個菌株進行室內生測試驗。

A：木霉TL09與病原菌FO16的平皿拮抗圖片； B：病原菌FO16單獨接種的平皿照片。

表1 木霉菌株與FO16平皿拮抗篩選實驗結果

表中相同小寫英文字母表示兩者間無顯著差異（≤0.05）。

2.2 室內生測試驗

結果顯示（表2），經TL09 WP和75%百菌清WP灌根處理的藏紅花植株的 DS和ERDC，都分別顯著性地≤0.05）低于或高于經TR121WP、TR358WP和清水對照處理藏紅花植株的DS或ERDC。根據此生測篩選結果，繼續選用TL09WP進行大田藥效測試。

表2 木霉菌WP防治藏紅花枯萎病室內生測試驗結果

病情指數是各處理3次重復的平均值，同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（≤0.05，Ducan氏新復極差法）。

2.3 田間藥效實驗

從表3可以看出，在2015和2016年的大田藥效實驗中，經TL09 WP 1 kg/畝（TR1）和2 kg/畝（TR2）以及75%百菌清WP（TR3）處理的DS、ERDC 或產量（除2016年的TR3外）之間，均無顯著性差異，但都分別顯著性（≤0.05）低于或顯著性高于空白對照（TR4）處理的DS和產量。

另外，根據2015和2016年的統計數據，2016年各處理的DS均低于2015年的DS，這可能是由多方面的原因，包括兩年試驗期間的天氣情況的不同所致（表3）。

表3 TL09 WP防治藏紅花枯萎病田間藥效實驗結果

表中各病情指數值是每個處理3次重復的平均值，同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（≤0.05，Ducan氏新復極差法）。

3 結論與討論

大力推廣和使用生物農藥，既可以提高農產品質量和產量，又可以減少由化學農藥所產生的各種污染。李衛平等[24]利用木霉菌WP對黃瓜、番茄、莧菜、茄子等進行苗期病害防治發現，經木霉菌處理的幼苗病害防治效果明顯，發病率都低于15%，而對照處理的幼苗發病率高達53.6%。同時，經木霉菌WP處理的黃瓜苗葉片濃綠、色深、生長勢強。楊春林等[25]研究表明，哈茨木霉不僅對黃瓜枯萎病的防治效果可達64.5%，同時還能增加植株的株高、地莖、葉片數以及品質等。臺蓮梅等[26]研究6株木霉菌株均能促進大豆植株生長，其株高、莖粗、根長、干物質積累均比對照增加，同時還可減輕根腐病的發生，當濃度為5×108個/g時，防效均在70%以上。本研究開展的兩年田間試驗結果表明，木霉菌TL09WP對藏紅花枯萎病有較好的防治效果。當TL09WP用量為1 kg/畝時，對病害的防效能達到64%以上，防治效果好于化學農藥75%百菌清WP。同時經TL09WP處理的藏紅花球莖在產量上也顯著高于空白和化學對照處理。

圖2 2015、2016 年試驗期間天氣對比

試驗期間的天氣狀況對病害的發生與發展程度，有著直接的影響。陳娟等[27]在研究木霉菌防治草莓苗期炭疽病時發現，臺風和雨水多的天氣會增加炭疽病發生的概率。李洪濤[28]在研究保護地的番茄灰霉病發生規律時發現，灰霉病害發生與天氣狀況密切相關，當有兩個以上連續陰雨日，有利于灰霉菌孢子大量產生、造成嚴重侵染，晴朗的天氣對灰霉病的傳播起到了抑制作用。王麗等[29]研究了近50年來以來不同的氣候條件包括氣溫、降雨、日照等對不同作物的病害發生有著明顯的影響。本研究結果表明，2015年試驗期間的降雨天數比2016年試驗期間多了9d，這樣的氣候環境更有利于藏紅花枯萎病病原菌的傳播和浸染。因此，這也許就是造成2015年的病情指數高于2016年的原因之一。

[1] 陳云章, 李玉芳. 西紅花的高產栽培技術[J]. 廣西農業科學, 2002, 39(6): 328-329.

[2] 楊全. 西紅花. 中草藥栽培技術Ⅱ[M]. 延吉: 延邊人民出版社, 2002: 151-154.

[3] 鄧穎, 郭志剛, 曾兆麟, 等. 藏紅花的藥理研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2002, 8(27): 565-568.

[4] 張國輝, 龍安輝, 賀定翔. 藏紅花球莖腐爛病的調查及初步分析[J]. 中國農學通報, 2007, 23(6): 516-518.

[5] 徐乃良. 名貴中草藥高產技術[M]. 北京: 北京醫科大學和中國協和醫院聯合出版社, 1993: 171-174.

[6] 周雙, 白潔, 陳放. 藏紅花腐爛病病原真菌的分離鑒定及藥劑防治[J]. 四川大學學報(自然科學版), 2015, 52(4): 911-916.

[7] 陳鴻逃, 王拱辰. 浙江鐮刀菌志[M]. 杭州: 浙江科學技術出版社, 1992: 27-29, 54.

[8] 沈洪坤, 匡開源. 黃德祟, 等. 西紅花球莖腐爛病的病原菌及藥劑測定[J]. 上海農業科技, 1996, 26(6): 36.

[9]Cappelli C. Occurrence off. sp. gladioli on saffron in Italy[J]. Phytopathologia Mediterra-nea, 1994, 33: 93.

[10] Gu Z F, Zhi Y. A study on biological characteristics ofon crocus[J]. Acta Agriculturae Shanghai, 1997, 13(4): 71.

[11] Sud A k, Paul Y S, Thakur B R. Corm rot of saffron and itd management[J]. Journal of Mycology and Plant Pathology, 1999, 29(3): 380.

[12] 匡開源, 許振光. 滬郊西紅花球莖腐爛病害的發生和藥劑防治[J]. 上海農業學報, 2000, 16(S1): 41-45.

[13] 沈洪坤, 匡開源, 黃德崇, 等. 西紅花球莖腐爛的病原菌及藥劑測定[J]. 上海農業科技, 1996, 26(6): 36.

[14] 張國輝, 張西平, 張年富, 等. 藏紅花球莖腐爛病的病原鑒定及藥劑預防[J]. 凱里學院學報, 2009, 27(3): 47.

[15] 周雙, 白潔, 陳放. 藏紅花腐爛病病原真菌的分離鑒定及藥劑防治[J]. 四川大學學報(自然科學版), 2015, 52(4): 911-916.

[16] 郭榮君, 劉杏忠, 楊懷文, 等. 芽孢桿菌BH1防治大豆根腐病的效果及機制 [J]. 中國生物防治, 2003, 19(4): 180-184.

[17] 陳雪, 趙克明. 土傳病害生物防治微生物的研究進展[J]. 植保土肥, 2011, 7(42): 34-35.

[18] 孟昭禮, 羅蘭, 尚堅, 等. 人工模擬殺菌劑銀泰對10種植物病原菌的室內生物測定[J]. 萊陽農學院學報, 1999, 16(2): 124-126.

[19] 丁立彤, 徐漢億, 丁立功, 等. 春佳對番茄灰霉病的防治效果[J]. 長江蔬菜, 2007(7): 19.

[20] 孟娜, 周守標, 蔣繼宏. 月腺大戟（）根部提取物抑菌作用的測定[J]. 生物學雜志, 2005, 22(4): 15-17.

[21] 曹翠玲, 趙晉銘, 路炳聲. 4 種木霉對核盤菌的抑制作用[J]. 仲愷農業技術學院學報, 2005, 18(4): 21-24.

[22] 唐文華, 張守安, 孫俊, 等. 木霉菌(spp.)的分離及其對水稻紋枯病菌()的拮抗作用[C]. 中國植病學會華北區分會第六屆年會暨內蒙古植保學會第三屆年會論文集, 1992.

[23] 匡開源, 許振光. 滬郊西紅花球莖腐爛病害的發生和藥劑防治[J]. 上海農業學報, 2000, 16(S1): 41-45.

[24] 李衛平. 綠色木霉對蔬菜苗期病害的防治和促生作用[J]. 浙江農業學報, 2000, 12(2): 106-107.

[25] 臺蓮梅. 木霉生防菌對大豆幼苗的促生作用及對根腐病的防治效果[J].安徽農業科學, 2013, 41(11): 4820-4821.

[26] 楊春林, 席亞東, 劉波微, 等. 哈茨木霉T-h-30對幾種蔬菜的促生作用及病害防治初探[J]. 西南農業學報, 2008, 21(6): 1603-1607.

[27] 陳娟. 木霉菌制劑防治草莓苗期炭疽病效果研究[J]. 現代農業科技, 2015, 34(7): 115-119.

[28] 李洪濤. 保護地番茄灰霉病流行規律及病害防治決策支持系統研究[D]. 保定: 河北農業大學, 2003.

[29] 王麗, 霍治國, 張蕾, 等. 氣候變化對中國農作物病害發生的影響[J].生態學雜志, 2012, 31(7): 1673-1684.

Study ofspp. Preparation Against Saffron Blight

GAN Hua-lei1, SU Peng2, YE Nai-wei3, WANG Cheng-fang4, KUANG Wen-feng5, MAO Wei-li*

(Shanghai Wanlihua Biological Technology Co., LTD, Shanghai 201203, China)

An indoor screening test was conducted with wettable powder (WP) formulations containing 2x108/g conidial spores of strain TR121, TR358 or TL09 ofspp. to prevent and control Saffron blight. The results showed that the disease severity (DS) of the saffron plants (SP) treated with TL09 WP was significantly lower (≤0.05) than that of the treatments of TR121 WP, TR358 WP, 75% chemical chlorothalonil and water controls. The formulation of TL09 WP was continually used in a field efficacy test to control the disease of Saffron blight in 2015 and 2016. The results revealed that the DS and the efficacy rate of disease control (ERDC, %) of the SP treated with TL09 WP of 15 kg/Hm2(TR1) and 30 kg/Hm2(TR2) were significantly lower or higher (≤0.05), respectively, than that of 75% chlorothalonil WP (TR3, only in 2015) and the control treatment (TR4). Meanwhile, the yields of the SP in TR1 and TR2 were significantly higher（≤0.05） than that in TR3 (only in 2015) and TR4.

spp.; Saffron blight; biological control; efficacy rate of disease control

S436.421.1+3

A

2095-3704（2018）01-0020-05

2017-12-04

2017-12-16

上海市科技發展基金“創新行動計劃”醫學與農業領域（16391902400）

干華磊(1987—)，男，農藝師，主要從事生物農藥的研發與推廣，hlgan1026@163.com；

通信作者：毛偉力，博士，weilimao@hotmail.com。

干華磊, 蘇鵬, 葉乃瑋, 等. 木霉菌制劑防治藏紅花枯萎病研究[J]. 生物災害科學, 2018, 41(1): 20-24.