江西水稻根結線蟲病的發生及鑒定

葉夢斐，孫曉棠，張 磊，崔汝強

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江西水稻根結線蟲病的發生及鑒定

葉夢斐，孫曉棠，張 磊，崔汝強*

（江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045）

2016年，江西省南昌縣和新建縣的直播水稻出現大面積的斑塊狀枯黃，調查發現這些水稻的根部具有根結，同時從土壤當中分離到大量的根結線蟲2齡幼蟲。運用分子生物學技術對采自這2個水稻種植地的根結線蟲進行鑒定，確定該根結線蟲為擬禾本科根結線蟲（）。擬禾本科根結線蟲病是水稻產區一種重要的線蟲病害，在我國江西則是首次發現。

擬禾本科根結線蟲；水稻；鑒定；江西

根結線蟲（spp.）廣泛分布于世界各地，寄主范圍廣，危害大，是最具危險性的植物寄生線蟲之一，世界每年由根結線蟲所引起經濟上重要農作物的損失占總損失的5%。水稻根結線蟲寄生在水稻根部，植株地上部僅表現株矮，葉黃，生勢衰弱等癥狀，根部有大量根結出現導致秧苗無法進一步形成須根。多發生在直播稻、育秧田、灌溉地水稻、低洼地水稻、旱稻等田塊。

由擬禾本科根結線蟲（Golden & Birchfield，1963）引起的水稻根結線蟲病是水稻產區重要的病害之一[1]。該線蟲病在北美洲、南非、東南亞等地發現并造成嚴重危害。一般中等發病情況下，影響水稻產量約10%~20%左右，嚴重發病時可達40%~50%[2-6]。目前引起水稻根結線蟲病的線蟲種類多種，而擬禾本科根結線蟲僅在我國海南三亞及福建的水稻、蔥（）有記錄[7-9]，但未見造成水稻損失的報道。近年來在江西南昌縣、新建縣等地發生水稻根結線蟲病，造成局部嚴重為害。鑒于其經濟重要性及病害的突發性，作者對病原線蟲進行鑒定，報道如下：

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2015年2—7月，在江西省的南昌和新建直播稻種植區采集水稻根及根際土。采用貝曼漏斗分離法[10]分離土壤中的根結線蟲雄蟲和2齡幼蟲，收集根結線蟲在水稻根部的卵囊，用單卵囊接種到溫室培養的水稻苗上，進行根結線蟲純化擴繁培養。

1.2 單條 0. nnnn活蟲DNA的提取

在解剖鏡下將水稻根結線蟲單條的二齡幼蟲用解剖刀切斷后加入含有8 μL WLB溶液［含2.5 mmol/L DTT，( Tween20) = 1.125%，0.25 g/L Gelatin，125 mmol/L KCl，3.75 mmol/L MgCl，25 mmol/L Tris－HCl ( pH 8.3) ］的PCR管中，于-70 ℃放置30 min后；95 ℃處理15 min；隨后65 ℃溫浴2 min；再加入20 mg/mL的蛋白酶K 1 μL，65 ℃溫浴30 min；95 ℃處理15 min后作為單根結線蟲PCR擴增的DNA模板[11]。

1.3 DNA鑒定

利用引物C2F3（5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′）和1108（5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′）[12]對水稻根結線蟲序列進行擴增。PCR反應的混合液總體積為50 μL。反應體系為：2 μL模板DNA，5 μL10×PCR buffer，4 μL dNTPs（10 mmol/L），1 μL引物ITS1/ ITS4（10 μmol/L），0.3 μL TaKaRa（5 U/L），36.7 μL ddH2O。反應程序：95℃，4 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min；32個循環；72 ℃延伸5 min。

1.4 PCR產物的電泳檢測

取PCR產物各3mL，12 g/L瓊脂糖中加5% EB染液，100 V電泳35 min，凝膠成像系統拍照。根據DL2000 Marker推斷PCR擴增產物大小。切膠回收PCR產物連接到pMD18T載體上，單菌落PCR篩選出來的陽性克隆。

1.5PCR產物測序及序列分析

陽性克隆送上海Life生物有限公司進行測序分析。測序結果登錄到GenBank 數據進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

水稻根結線蟲病在整個水稻生育期都能感染發病，目前江西主要在直播稻的苗期發病明顯。發病部位主要在水稻根部，地上部分表現出植株矮小，黃化，生長不良等癥狀。

圖1 水稻根結線蟲病在水稻根部的主要癥狀

水稻根結線蟲病，由根結線蟲二齡幼蟲自根冠上方侵入到水稻根部，在根內尋找寄生位點并與水稻建立寄生關系，進一步發育成成蟲。在根結線蟲食道腺分泌的效應子的作用下于寄生位點形成巨型細胞，造成水稻根部膨大形成根瘤，并影響水稻須根的形成（圖1），進而影響秧苗對水分和營養的吸收，地上部分表現為秧苗矮小，黃化，生長不良，分蘗量下降等癥狀（圖2）。

圖2 水稻根結線蟲病田間癥狀

2.2 PCR擴增結果

采用引物C2F3和1 108對擬禾本科根結線蟲DNA序列PCR擴增，經12 g/L瓊脂糖電泳檢測分析顯示，各單條線蟲樣品均增出特異性較好片段約為500 bp的產物（圖3）。

圖3 單條擬禾本科根結線蟲擴mtDNA電泳

2.3 分子鑒定結果

對PCR產物進行測序，測序結果表明該片段為531 bp，將該片段登錄GenBank數據庫進行比對分析顯示與數據庫中已知擬禾本科根結線蟲（GU187309)同源性為100%?？蓪⒃摼€蟲鑒定為擬禾本科根結線蟲。

3 討 論

本研究利用特異DNA序列鑒定出在江西省的南昌和新建的直播稻發生的水稻根結線蟲病的的病原為擬禾本科根結線蟲，目前該病原線蟲已經對江西省部分直播稻種植區造成了嚴重的經濟損失，本研究也是首次對江西省擬禾本科根結線蟲為害直播稻的詳細報道。1963年在美國路易斯安那州的光頭稗（L.）上首次發現了擬禾本科根結線蟲[11]，隨后研究表明該線蟲可寄生水稻、蔥以及多種單子葉雜草的根部，為害水稻后會造成嚴重減產，甚至毀田[12]。

江西省地處亞熱帶溫暖濕潤季風氣候，雨量多、年平均氣溫在16~19 ℃，而且作物經常多年連續種植，導致各種病害發生嚴重，且在水稻生長季節特別適合根結線蟲病的發生。一旦根結線蟲在水稻種植區定殖下來，很難將其根除。防治該病害則會浪費大量的財力與人力。因此水稻根結線蟲病的預防是直播稻生產管理的一個重要問題。由于以前在我省水稻上并為大面積發現水稻根結線蟲病為害，而且水稻根結線蟲病地上部分表現的癥狀與營養不良、缺素癥等癥狀類似，容易被農民及農技推廣人員忽視。為了保證江西省糧食生產安全，應對我省主要的直播稻種植區開展水稻根結線蟲病害的普查及防治推廣培訓工作；同時，在播種前，對前一生長季節疑似發病的田塊進行土壤處理，且定期做好除草工作。

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Identification ofFrom Rice in Jiangxi Province

YE Meng-fei, SUN Xiao-tang, ZHANG Lei, CUI Ru-qiang*

(School of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In 2016, yellow patches emerged on rice in Xianjian County and Nanchang County of Jiangxi Province. Root knots were observed in the rice roots, and numerous juvenile second stage (J2) worms belonging to the genuswere isolated from soils around the rice roots. The root knot nematodes were identified by using mtDNA-PCR-sequence. The results indicated that the root knot was. Worldwide,is known to be an important pathogen of rice in most rice growing area, however, the nematode was found firstly on rice in Jiangxi Province.

；rice；identification；Jiangxi

S432.4＋5；Q959.17

A

2095-3704（2018）01-0052-03

2017-11-04

2017-11-21

國家自然科學基金項目(31260423)、江西省自然科學基金項目（20151BAB204024）、江西省科技支撐計劃(20151BBF60076)和江西省教育廳基金項目(GJJ160347)

葉夢斐(1993—)，女，碩士生，主要從事植物病理學研究，1193315379@qq.com；

通信作者，崔汝強，副教授，博士，cuiruqiang@jxau.edu.cn。

葉夢斐, 孫曉棠, 張磊, 等. 江西水稻根結線蟲病的發生及鑒定[J]. 生物災害科學, 2018, 41(1): 52-54.