禾本科植物細胞壁合成調控研究進展

胡煒晨， 張 同， 胡 振， 王令強

(華中農業大學植物科學技術學院/華中農業大學生物質和生物能源中心，湖北 武漢 430070)

植物細胞壁是由纖維素、半纖維素、木質素等構成的網狀結構，是植物細胞區別于動物細胞的基本特征之一。細胞壁與植物生長發育密切相關，維持細胞的基本形態，為植株提供機械支撐。此外，細胞壁還在營養物質轉運、信號傳導、花粉開裂、育性、抵御外界環境脅迫等方面發揮廣泛的作用。

作物莖稈強度反映了細胞壁的物理特性，是一個重要的農藝性狀，與產量、抗性等直接相關[1-3]。另外，纖維素、木質素等細胞壁成分可作為重要的化工原料。特別是近些年來，木質纖維素作為第二代生物能源物質，因清潔可再生，兼具能源、材料和環保的綜合效率，正日益受到關注[4]。

秸稈的理化性質如抗倒伏性能的改善、秸稈綜合利用效率的提高都有賴于對細胞壁合成調控機理的認識[5-7]。同時，細胞壁作物植物區別于動物的一個進化特征，其形成和調控的分子機制是一個有待于研究的基礎科學問題。2005年，Science雜志在其創刊125周年時就提出把“植物如何形成細胞壁”作為接下來25年需要解決的重要科學問題之一[8]。近十多年來，植物細胞壁合成調控分子機制研究已在國內外引起重視，并且取得了一定的發展。本文以農作物水稻、小麥和玉米為對象，從研究策略的角度綜述了禾本科植物細胞壁合成調控的研究進展。

1 莖稈突變體在禾本科植物細胞壁合成調控研究中的應用

莖稈突變體(易脆、倒伏等)是研究植物細胞壁的寶貴材料。目前，在擬南芥、水稻、玉米、大麥、小麥和高粱等中均發現了莖稈突變體。采用正向遺傳學研究策略，通過發現和創建突變體，開展基因圖位克隆和功能研究，為植物細胞壁合成調控機理的研究打下了基礎。

1.1 水稻莖稈突變體的發現和基因克隆

水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物，也是單子葉模式植物。禾本科植物細胞壁合成調控機理的認識主要來自于對水稻的研究。自1963年Nagao等[9]首次發現水稻脆莖突變體bc1以來，已有50多年歷史。早期發現的6個脆稈基因(bc1～bc6)，有5個通過經典遺傳學的三體定位法定位在不同的連鎖群上[10]。但直到2003年，中國科學家克隆了水稻脆稈突變體基因bc1，才有了突破性進展。bc1主要在厚壁組織細胞和維管束中編碼一個胞外磷脂酰肌醇(GPI)錨定類Cobra蛋白，突變降低細胞壁厚度和纖維素含量，增加木質素含量[11]。隨后，2003年Tanaka等[12]發現了3個新的脆稈基因，分別編碼水稻纖維素合酶3個亞基(OsCESA4、OsCESA7、OsCESA9)，位于第1、10染色體，與以前的脆稈基因不等位。2007年，Yan等[13]克隆了bc7(t), 并發現該基因就是纖維素合酶基因4(OsCesA4)。與Tanaka等[12]報道的OsCesA4不同，該突變體株高沒有改變。此后，每年都有脆稈基因的發現和克隆，如bc3[14-15]、bc10[16]、bc11[17]、bc12[18]等。Zhou等[16]克隆了bc10，研究結果表明bc10編碼植物中新發現的一個糖基轉移酶，該酶在高爾基體中合成，突變影響了纖維素和阿拉伯樹膠酸蛋白(AGPs)的合成。Li等[19]克隆的一軟稈易倒伏基因(fc1)編碼木質素合成途徑中肉桂酰乙醇脫氫酶(CAD)，主要在維管束厚壁細胞的次生細胞壁中表達，突變造成纖維素、木質素含量和H單體含量的降低，細胞壁變薄。BC14 編碼尿苷二磷酸葡萄糖轉運蛋白, 該轉運蛋白能將核苷酸糖從胞質運入高爾基體中，它的缺陷造成眾多含葡萄糖基的多糖合成異常[20]。這些研究初步揭示了水稻細胞壁合成調控分子基礎，表明細胞壁合成涉及各細胞學過程，其中包括參與纖維素催化合成(如BC1、BC11)、基質多糖形成/糖蛋白修飾(BC10/fc116)、細胞壁骨架的形成(BC12)以及囊泡運輸(BC3)等。2011年，Zhang等[21]總結了水稻脆稈基因圖位克隆和功能研究進展，闡述了脆稈突變體在細胞壁合成調控機理研究中的重要性。最近幾年，水稻中仍有脆稈基因(bc13[22]、bc14[20]、bc15[23])的克隆和報道。這些突變體基因的克隆和研究不斷豐富我們對禾本科細胞壁合成調控機理的認識。

1.2 禾本科植物細胞壁合成調控機理的復雜性

莖稈突變體的研究結果和基因克隆實踐表明，植物細胞壁合成調控機理復雜。從基因性質來說，細胞壁合成變化不僅與負責其成分物質合成的基因直接相關，而且還與一些起降解作用的纖維素酶(Korrigan)和類幾丁質酶(Chitinase-like)密切聯系。Bc15編碼沒有幾丁質酶活性的水稻類幾丁質酶，突變后引起莖稈厚壁細胞纖維素含量降低，次生細胞壁變薄[23]。有些莖稈強度突變體是通過改變纖維素微纖絲的定向沉積而影響莖稈強度，如bc12[18]。研究結果表明，COBRA類蛋白BC1N端碳水化合物結合結構域(Carbohydrate binding module,CBM)可結合結晶態纖維素，通過調節其微纖絲結晶度來影響次生細胞壁的薄厚及莖稈機械強度[24]。從細胞壁組成看，三大成分纖維素、半纖維素和木質素中任何一個改變，均可以導致整體上細胞壁結構和功能的改變。而這種改變可能涉及基因調控也可能是結構上的一個物理性互補。而且，初生細胞壁相關基因的改變也可進一步導致次生細胞壁的變化。對半纖維素的修飾如乙酰化和去乙酰化，可造成次生細胞壁的改變[25-26]。初生細胞壁和次生細胞壁的相互關系，以及初生細胞壁和次生細胞壁的基因分類和功能有待進一步明確。另外，禾本科植物細胞壁合成調控網絡研究正方興未艾。目前有2篇報道分別利用候選基因轉化和圖位克隆法研究了水稻中轉錄因子(OsMYB103L)對細胞壁合成的調控機制[27-28]。MYB轉錄因子可以調控纖維素合酶基因的表達水平，進而使植株纖維素含量及莖稈強度發生改變[27]。張保才等[29]從植物細胞壁結構與成分、細胞壁物質合成、細胞骨架在細胞壁形成中的作用、細胞壁形成的信號與轉錄調控網絡以及研究技術的發展等幾個角度闡述了植物細胞壁合成調控的新進展。這幾年的研究重點，主要體現在基因的轉錄調控、纖維素合成復合體、非纖維素多糖修飾、外界環境和激素的調控，以及細胞壁各組分間的協同變化等幾個方面。

1.3 莖稈突變體在細胞壁研究中的局限性

莖稈突變體為細胞壁合成調控的研究提供了切入點，在研究的早、中期發揮了重要的作用。但該方法的局限性在于：(1)材料難獲得。由于家族基因互補等原因，有些細胞壁相關基因突變后性狀無明顯變化，很難通過表型鑒定獲得。(2)依賴圖位克隆，過程較漫長。水稻中雖然有很多T-DNA等插入突變體，理論上可利用側翼序列分離等方法克隆基因，但成功不多。目前只有CESA(Tos17)和fc1(T-DNA)克隆報道[12,19]。(3)重復性難避免。克隆的基因往往與已發表的基因等位，如本實驗室發表的fc116/bc10[30]和OsCESA9[31]。(4)絕大多數為結構基因，對細胞壁合成起直接作用，網絡中上游的調控基因難以發現。水稻中通過莖稈突變體圖位克隆的轉錄因子基因，目前只有OsMYB103L[28]。因此，隨著研究手段的多樣化，莖稈突變體已不再扮演主要角色。盡管如此，目前仍有脆稈基因被陸續發現和克隆，如bc16、bc17、BS1的克隆。因此，脆稈突變體的研究在細胞壁合成調控研究中仍發揮作用。

2 秸稈細胞壁相關性狀的數量遺傳學研究進展

植物細胞壁理化性質是多基因控制的復雜性狀。定位和研究秸稈細胞壁數量性狀位點(QTL)，進而克隆相關基因進行功能研究和利用，是另一種正向遺傳學研究手段。秸稈相關性狀的遺傳學研究，早期僅有一些抗倒伏、莖稈木質化性狀以及飼料纖維素和木質素含量和可消化性的QTL的定位報道。隨著對生物質飼料和生物質能源的重視，目前玉米、大麥、燕麥、小麥和水稻等禾本科作物的細胞壁性狀遺傳學研究取得了一定的進展。

2.1 玉米秸稈相關性狀的QTL定位

玉米是重要的青儲飼料，又是美國等國家重視的能源作物，所以較早開展了秸稈細胞壁相關性狀的數量遺傳學研究。葉鞘和莖稈的中性可洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸可溶木質素(ADL)性狀的QTL定位研究結果[32-34]表明秸稈性狀存在相關性，相關QTL位置和效應有一致性，比如對纖維性狀QTL的選擇可提高秸稈的可消化性。另外，發現QTL與纖維素或淀粉合成途徑的基因連鎖。Barrière等[35-36]利用F838×F286重組自交系對控制木質素含量、木質素單體含量和對羥基肉桂酸含量以及細胞壁可降解性的QTL進行了定位。Barrière等[37]利用WM13和Rio雜交的重組自交系定位了木質素含量QTL。其中一個影響Klason木質素含量的主效QTL可解釋43%的遺傳變異；另外還定位了對羥基肉桂酸含量QTL 13個、木質素單體含量QTL 9個。該研究進一步與前人的5個RIL群體的結果進行系統比較總結，一共得到50個QTL與ADL/NDF有關，涉及23個單一位點，有53個QTL與體外消化率(IVNDFD)有關。研究發現細胞壁相關性狀QTL往往成簇分布，還存在很多QTL并沒有與細胞壁單體合成和多聚化相關的基因對應，推測這些位點可能與對木質素合成和次生細胞壁沉淀的調控基因有關，有待進一步研究。

2.2 其他禾本科作物秸稈相關性狀的QTL研究

除玉米外，在燕麥和大麥中也已檢測了一些影響細胞壁可消化性、纖維品質、木質素含量、半纖維素成分、糖成分等相關性狀的QTL[38-39]。小麥中莖稈強度、莖粗和稈壁厚度相關性狀QTL可較好地用于小麥抗倒伏選擇育種[40-41]。值得一提的是，在對大麥半纖維素成分MLG含量的QTL定位中，發現一主效QTL，對該QTL精細定位，并利用水稻同源區段比較克隆和驗證了該基因功能，研究結果發表在Science雜志上[42]。而在水稻中，Okawa等[43]利用染色體片段代換系鑒定出莖稈厚度QTL(SCM2)并將其克隆，發現其與影響穗結構的APO1基因等位。研究進一步發現攜帶SCM2的近等基因系莖稈強度增強同時穗粒數增加。該研究結果為提高水稻的抗倒伏能力和產量提供了新思路。

2.3 禾本科植物細胞壁成分和酶解產糖效率的QTL研究

盡管植物細胞壁相關性狀的QTL定位逐漸增多，但真正涉及細胞壁理化性質的定位不多。在秸稈抗倒伏研究方面，由于指標和群體問題，真正與秸稈密切相關的QTL很少定位到，目前也沒有從細胞壁組成和結構特性等內在層面展開。在秸稈相關化學性狀方面，由于缺乏高效的細胞壁分析平臺，對細胞壁單糖組成和木質素單體的定位還很少，也幾乎沒有生物質能源轉化效率的數量遺傳學研究。擬南芥中最早開展了細胞壁成分如木質素相關性狀和可降解性的QTL定位研究[44-45]。在玉米中，利用玉米品種B73和Mo17構建重組自交系，定位了152個玉米秸稈酶解葡萄糖釋放量和細胞壁組分相關的QTL，為能源作物分子標記輔助選擇打下了基礎[46]。隨后的Barriere[36-37]的QTL定位研究也涉及了一些秸稈木質素單體和可降解性。2014年，Penning等[47]利用玉米重組自交系對木質素含量和酶解產糖進行了QTL定位，檢測到木質素含量、4-乙烯基苯酚含量和酶解產糖相關的QTL，在該群體中苯酚類物質含量的QTL與糖釋放量的QTL并無關系，他們推測有其他非木質素細胞壁因子影響了該群體的酶解轉化效率。在水稻中，Zhang等[21]利用野生稻Yuanj和Teqing的導入系群體定位了與半纖維單糖含量相關的QTL，其中4個木糖和葡萄糖含量相關的QTL貢獻率可達20%。最近在四倍體小麥和二棱春大麥中，利用自然群體對阿拉伯木聚糖含量進行了關聯分析[48-49]。這些秸稈細胞壁成分相關QTL的定位，給秸稈農藝性狀的遺傳改良帶來了便利，也為隨后的基因克隆建立了基礎。

2.4 植物細胞壁組成和酶解產糖效率分析平臺在數量遺傳學研究中的應用

長期以來，缺乏快速、準確的性狀測定方法而無法完成對大規模群體的分析，是細胞壁數量遺傳學研究的瓶頸。最近，近紅外光譜分析技術(NIR)和高通量細胞壁分析測定技術平臺在生物質能研究領域的應用值得關注。NIR具有快速、無損、環保、無前處理的特點，可實現對大量樣本的高通量測定[50]。目前，該技術已應用于生物質和生物能源領域，例如秸稈的化學成分測定[51]，大麥燃料酒精品質和谷類種子產生酒精的潛力[52-53]，小麥秸稈細胞壁成分分析及秸稈的可降解性預測[54-55]。Templeton等[56]利用近紅外光譜技術結合偏最小二乘法(NIR/PLS)測定了來自美國8個玉米種植帶的508份商業化雜交玉米秸稈樣品細胞壁成分的變異。最近，本課題組利用NIR對不同預處理條件下芒草和水稻細胞壁成分和酶解轉化效率進行了近紅外建模[57-58]。

最近幾年開發的一些細胞壁成分自動化分析系統，可采用不用預處理模式，實現對大規模樣品的分析。這些分析系統具有快速、重復性好、精密度高、結果可比性強等明顯優點，可用于生物能源研究和其他工業生產[59-60]。美國能源部大湖能源研究中心(DOE-GLBRC)開發的高通量木質纖維降解轉化分析平臺用于篩選降解效率提高的種質資源[60]。該平臺可在16 h內研磨和稱取1～5 mg的樣品250份，并在后續的36 h內自動化完成預處理、酶解和產糖分析，非常適合于優異種質資源或突變體的大規模篩選。另外，他們開發了核心取樣系統(CSD)，單人操作便可在8 h內完成1 000份以上樣品的取樣，取樣均勻一致，無交叉污染，樣品采集后可馬上放入冰浴、干冰和液氮中保存[61]。該平臺已接受來自全美細胞壁研究相關單位的樣品(與美國能源部植物實驗室DJ Walton教授的交流)。本課題組利用GLBRC高通量測定平臺測定了水稻重組自交系中細胞壁半纖維素單糖組成、木質素含量和單體組成以及酶解轉化效率，并定位QTL，探討在能源植物改良中的應用。這些技術平臺的開發無疑將大大加快細胞壁相關性狀的數量遺傳學研究進程。

3 細胞壁合成調控網絡研究中的基因共表達分析

細胞壁的合成和代謝涉及大量基因，是一個精細的時空調控網絡。科學家預測植物中有超過10%的基因直接參與細胞壁的代謝過程[62]。隨著生物信息學以及大數據的發展，采用反向遺傳學策略，通過生物信息學等手段篩選和預測相關基因，進行基因克隆和功能驗證是目前細胞壁研究領域的主流。

3.1 表達譜與植物細胞壁研究

表達譜數據庫提供基因對不同環境和處理的響應信息和在不同組織的時空表達情況。基因改變或者外界環境刺激，會引起相關代謝途徑基因的協同改變。Gou等[63]研究了棉花纖維伸長過程中的基因表達譜和代謝變化。Guillaumie等[64]研究了在煙草中超量表達WRKY12 對木質素途徑基因和木質部的發育影響。另外，表達模式相近的基因往往具有功能關聯性，通過基因功能富集分析，可有效推斷新基因功能[65-66]。此外，結合基因組的非編碼序列分析可找出共表達基因共有的順式作用元件，進而構建調控網絡[67-68]。擬南芥中，從2005年起全基因組共表達分析開始被用來預測細胞壁基因網絡[69-70]。Persson等[69]利用編碼次生細胞壁纖維素合酶3個亞基的相關基因(AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8)為誘餌，鑒定了與之表達趨勢一致的基因。共表達基因包括β-1,4內切葡聚糖酶基因、木質素合成相關基因(如PAL、COBRA-Like基因)以及與木聚糖等細胞壁等多聚物的合成糖基轉移酶基因家族成員[71]。最近，Gu等[72]在擬南芥中利用共表達分析結合酵母雙雜交成功篩選并驗證了初生細胞壁的纖維素復合體相關基因CSI1，證明該方法對于發現次生細胞壁調控網絡相關基因和蛋白質復合體組成基因都具有重要作用。

3.2 共表達分析在水稻細胞壁調控網絡研究中的應用

在水稻中，大量積累的基因組數據為細胞壁合成調控網絡研究提供了基礎。水稻中目前有很多全基因組表達數據庫可以利用，如CREP水稻全生育期基因表達芯片數據庫涵蓋了水稻整個生長發育的33個組織器官的表達信息[73]。Wang等[74]利用該數據庫，首次在水稻細胞壁研究中進行基因共表達分析嘗試。通過對水稻纖維素合酶超基因家族(OsCesA/CsL)和Cobra基因家族的表達模式分析，發現這些基因家族存在廣泛的和功能相適應的共表達模塊。如水稻初生細胞壁纖維素合酶的3個亞基基因(OsCesA1、OsCesA3、OsCesA8)密切共表達，次生細胞壁細胞壁纖維素合酶的3個亞基基因(OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9)密切共表達。隨后，Xie等[75]也利用CREP數據庫結合突變體分析對水稻纖維素酶相關基因開展了研究，發現纖維素酶相關基因中GH9A3和GHB5與初生細胞壁纖維素合酶基因(OsCesA1、OsCesA3、OsCesA8)共表達，預測參與細胞壁纖維素合成，而GH9B、GH9B1、GH9B16可能與纖維素的結晶度有關。Guo等[76]發展了一種加權基因共表達網絡分析方法，結合CREP數據庫進行系統的全基因組共表達分析，推測了與初生細胞壁、次生細胞壁合成和建構，半纖維素修飾和降解以及與木質素G 單體合成相關基因模塊，并分析了模塊間和模塊內各基因相互關系，注釋了基因的功能和代謝途徑，初步建立了與水稻細胞壁合成調控相關的基因共表達網絡。另外，中國科學院周奕華研究員課題組也通過對發育莖稈的轉錄組測序，正在篩選和驗證次生壁合成調控的關鍵轉錄因子。通過基因的共表達分析，大規模的關鍵基因功能驗證，有望最終揭示次生細胞壁合成調控機理。

4 展 望

細胞壁的合成調控機理復雜，涉及基因眾多。細胞壁各成分含量、沉積方向、結晶度、聚合度的改變均能夠影響細胞壁的理化特性。此外，植物為適應生長發育需要和多變的環境，細胞壁結構組成也動態可變，這就需要靈活多樣的調控途徑。以水稻為代表的禾本科植物細胞壁合成調控分子機制研究起步較晚，但已取得了長足進步，并表現以下的趨勢。

莖稈突變體的發現為細胞壁研究作出了歷史性貢獻，至今仍在發揮作用。另外，新的研究手段也在不斷豐富細胞壁研究的內容。在擬南芥中，2005年后開始采用綜合研究策略研究細胞壁相關基因特別是對轉錄因子的研究。通過表達分析(如激光微切割技術分離不同細胞壁處于不同發育階段的樣品)，結合定量PCR和GUS染色，轉錄因子文庫和酵母單雙雜交以及遺傳互補等手段，初步揭示了NAC、MYB、WRKY等轉錄因子參與擬南芥次生細胞壁合成的調控網絡[77]。2015年，Taylor-Teeples等[78]系統闡述了從最關鍵的調控因子E2Fc出發，通過調控VND6、VND7等一系列轉錄因子，最終調控次生細胞壁基因表達的網絡通路。目前，在禾本科模式植物水稻中DNA序列及基因組注釋、基因芯片表達譜、蛋白質互作、轉錄因子、2D蛋白質數據、質譜、代謝網絡等新類型數據庫紛紛建立并偶聯。顯然，禾本科植物可以借鑒擬南芥的研究成果和策略。以生物信息學為出發點，綜合應用各種手段研究細胞壁合成調控網絡已經成為研究重點。

細胞壁高通量分析平臺的建立克服了細胞壁性狀數量遺傳學研究的技術瓶頸，為大規模細胞壁性狀測定和QTL定位帶來了極大的便利。細胞壁QTL定位和數量遺傳學的研究進展，將為分子標記輔助選擇改良作物秸稈性狀建立基礎，但是精細定位克隆相關QTL尚待時日。

如果說化學分析技術平臺的建立大大拓展了細胞壁研究的廣度，那么核磁共振波譜技術(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)、原子力顯微鏡(Atomic force microscope,AFM)等技術的應用，將細胞壁結構的研究推進到分子和納米水平。如利用 X-射線衍射技術，可以推測纖維素鏈結合模型，并區別疏水和親水表面[79]。核磁共振波譜技術具有非破壞性、信息量大、可獲得細胞壁天然結構信息的優點，已被廣泛用于纖維素晶體結構、多糖結構與修飾及木質素結構分析。糖組學技術利用細胞壁多糖單克隆抗體和免疫組化技術, 可對各種類型細胞進行細胞壁組成原位分析。而糖抗體與酶聯免疫吸附測定技術(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)結合發展出了新的類似芯片分析的技術，可快速、高通量獲得細胞壁結構成分信息[80]。原子力顯微鏡達到納米級的分辨率，可觀察細胞壁自然形貌，可對纖維素晶體大小以及與半纖維素的相互作用進行觀察和計算[81]。

近年來，已有一些相關的研究者報道了環境因子和激素對細胞壁合成調控的影響。水稻MYB103轉錄因子可調控細胞壁合成代謝[27-28]。細胞膜上的受體類激酶(RLK)既可作為一些信號分子的重要受體，又可將信號跨膜轉移傳遞到細胞內，成為細胞壁信號通路的重要元件。最近，外界環境因子和激素(如赤霉素和油菜素內脂)參與細胞壁合成調控的報道逐年增多[28, 82-85]。如與赤霉素(GA)相關的DELLA蛋白可與正調控水稻纖維素合酶基因的轉錄因子NAC29/31互作，促進其降解從而抑制纖維素合酶基因的表達[84]。可以預期，與激素信號和外界環境刺激相關的植物細胞壁合成信號通路和基因網絡將成為研究的熱點。

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