豬圓環病毒2 型吉林分離株的全基因組序列分析

苗麗娟, 劉東旭, 尹柏雙

(1.吉林農業科技學院動物科技學院, 吉林 吉林132101 ;2.預防獸醫學吉林省重點實驗室, 吉林 吉林132101)

豬圓環病毒2 型(PCV2 ) 隸屬于圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬成員,是迄今為止發現的最小的動物病毒之一[1],是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等相關疾病的主要病原[2],PCV2 可引起免疫抑制,繼發其他疾病感染,給養豬業造成巨大的經濟損失。

PCV2 包括不同亞型,有PCV -2a,PCV -2b,PCV-2c,PCV -2d[3]四種亞型,試驗表明,病理癥狀的不同,毒株之間的差異比亞型之間的差異更重要。 PCV2 隱性感染一直存在,本課題組主要進行豬病毒病的分子診斷,對于送檢的陽性病料進行分離培養,2017 年3 月從送檢到我實驗室的陽性豬體上分離出一株PCV2,命名為PCV2 -2017。 本試驗通過對PCV2 基因組序列的測序分析,為該病的防治提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 毒株 2017 年從吉林省某豬場送檢的病豬分離出1 株PCV2,命名為PCV2 -2017。

1.2 主要試劑 DNA 提取試劑盒、質粒提取試劑盒,購自康為世紀生物科技有限公司;Taq DNA 聚合酶(含10 ×Buffer 25 mmo1/L MCl2)、 dNTP、pMD18-T 寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 方法

1.3. 1 引物的設計與合成 根據GenBank 中PCV2 保守區進行全基因組序列,設計了4 對引物,引物序列見表1,引物由長春庫美生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCV2 DNA 的提取 按照Universal Genomic DNA Kit 試劑盒操作說明書,從細胞培養液中提取病毒基因組中DNA,用適量的TE 溶解, -20 ℃,保存備用。

1.3.3 PCV2 全基因組的擴增、克隆和測序 應用Oligo 6.24 軟件設計的PCV2 4 對引物, PCR 的反應體系為25 μL,1 μL 的up/low(20 pmol/μL)、3 μL dNTP(2. 5 mmol/μL),2. 5 μL 的10 × Buffer、0.25 μL的r Taq 酶、14.25 μL 的滅菌水,反應條件為35 個cycle,預變性94 ℃5 min 后,進入循環94 ℃50 s,56 ℃1 min 30 s,72 ℃50 s,72 ℃延伸7 min。 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶,將目的基因與pMD -18T 載體連接轉化,將鑒定后陽性菌送長春庫美生物工程有限公司測序。

表1 擴增PCV2 全基因序列的引物

1.3.4 PCV2 全基因組、Rep、Cap 和ORF3 基因的序列比對分析 采用DNAStar 軟件進行序列拼接,使用MegAlign 將PCV2 -2017 與GenBank 中收錄的PCV2 的國內外參考毒株的全基因組序列、ORF1、ORF2 基因、ORF3 基因變異性和同源性進行分析,分析其遺傳進化關系,參考毒株見表2。

表2 進化分析采用的參考毒株

2 結果

2.1 全基因組序列分析 用DNAStar 軟件將測得的序列進行拼接,結果表明,PCV2 -2017 毒株全長1 767 bp。 核酸同源性分析表明,與法國株AF055394同源性最高,可達99 %,與美國株AF055391、四川株HM102350 同源性最低,為96%。 用MegAlign 分析PCV2-2017 毒株與GenBank 中收錄的其他PCV2 毒株的遺傳進化關系,結果見圖1,由圖1 可以看出,PCV2 毒株可以分為2 個分支,其中1 個分支中AY322001、AB426905 和國內GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393 毒株親緣關系較近;PCV2 -2017 新分離株與HM102350、JQ809464、GU124593、AF055394、AF055391、GU325757、JX512856 組成第2個分支,與法國株AF055394 親緣關系最近,同屬于PCV-2b 亞型,與JQ809464、HM102350、GU124593 親緣關系也較近。

2.2 ORF1 和ORF3 基因序列變化和同源性分析 PCV2 -2017 毒株中ORF1 基因全長946 bp,編碼Rep 蛋白,GenBank 上核酸和氨基酸同源性分析,結果同源性都為99%,在867 nt C 變為T,導致丙氨基酸變為纈氨基酸。

PCV2 -2017 毒株中ORF3 基因長為315 bp,核酸同源性比對結果為100%,ORF3 編碼的蛋白,與病毒在機體內的致病性和病毒誘導細胞凋亡有關,說明該蛋白比較保守。

圖1 部分PCV2 基因組序列構建的遺傳進化分析PCV2 -2017 本試驗新分離株

2.3 ORF2 基因的序列變化和分析 PCV2 -2017新分離株中Cap 基因長度為702 bp,編碼Cap 蛋白,在GenBank 中進行核酸同源性比對,核苷酸同源性在96% ～99%之間;氨基酸同源性比對,同源性在94% ～99%之間,說明PCV2 變異主要發生在ORF2區,共有12 個點突變,突變主要集中在670 nt ～680 nt 之間,有4 個位點突變,其余分散于ORF2 的其他位置,部分結果如圖2 所示。 導致相應的氨基酸也發生改變,這是否導致抗原性發生改變還需要進一步研究。

圖2 PCV2 -2017 吉林株ORF2 核酸序列部分對比結果

3 討論與分析

通過本試驗獲取吉林新分離株PCV2 -2017,并對全基因組結構進行序列分析。 本次獲得PCV2 基因組全長1 767 bp,與PCV-2b 亞型參考株AF055394親緣關系最近,所以屬于PCV-2b 亞型,2003 年以前PCV-2a 為主要的流行毒株,現在PCV-2b 為流行的主要毒株[4-6]。

PCV2 -2017 ORF1 經過測序拼接后長度為946 bp, ORF1 編碼Rep 蛋白,僅在867 nt 位置C 變為T,導致272 aa 變異,由丙氨基酸變為纈氨基酸,對其功能是否有影響還需要進一步探究,Rep 蛋白與病毒的復制相關,比較保守;ORF3 長度為315 bp,編碼的蛋白與病毒的致病性有關,能誘導細胞凋亡;ORF2 測序拼接后長度為702 bp,編碼Cap 蛋白,Cap 蛋白是PCV2 的主要結構蛋白,與病毒的致病性和抗原表位有關,具有較大的變異性,是刺激機體產生免疫保護應答的重要靶抗原。