白細胞介素-6快速定量熒光免疫層析試紙條的制備及特性研究

張文琪，何小維△，李　凱，劉曉云，李文美

(1.華南理工大學食品科學與技術學院，廣州 510000；2.廣州萬孚生物技術股份有限公司，廣州 510000；3.南方醫科大學公共衛生與預防醫學學院，廣州 510000)

白細胞介素(IL)-6在人體健康中扮演著重要的角色。通常情況下，血漿中的IL-6會隨著年齡的增長其水平逐漸降低，當成長為健康成年人時血漿中IL-6水平將低于10.00 pg/mL[1]。雖然人在健康的情況下IL-6在血清中水平很低，但是在某些疾病狀態下血液中IL-6的水平異常升高，如在炎性反應的早期階段[2]，IL-6的水平可以增加到10 000倍，因此，IL-6是一項有用的促炎細胞因子標記物。目前發現，IL-6已與多種疾病相關，例如已發現佩吉特病和多發性骨髓瘤患者與IL-6水平的升高有良好的線性關系[3]。冠心病作為炎性反應疾病中的一種，已有研究表明，動脈粥樣硬化的各個階段都有慢性炎性反應的參與[4-5]。IL-6的急劇升高會引起急性炎性反應[6]，也與損傷、感染、壓力、腦死亡和其他情況相關[7-9]。因此，監控人體內的IL-6水平具有重要意義。

目前，IL-6比較經典的檢測方法有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)[10]、化學發光法[11]、免疫膠體金法[12]。LUO等[11]研究了運用化學發光免疫方法檢測人源IL-6，該方法檢測IL-6的范圍為4.00～625.00 pg/mL，最低檢出限為0.50 pg/mL。IDA等[12]用傳統的ELISA對人的IL-6檢測方法進行了研究，檢測限可達9.50 pg/mL，但是檢測時間較長，需要4.5 h。MAN等[13]將膠體金作為標志物并運用免疫層析的技術檢測IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，直接觀察結果無需儀器讀取，肉眼可見IL-6的最低檢測限為62.50 ng/mL。熒光膠乳免疫層析技術與免疫放射方法相比，操作安全無污染、無需專業操作員操作；與化學發光法、ELISA相比，設備價格低廉、操作簡便等；與免疫膠體金方法相比，本試驗制備的靈敏度更高的試劑盒進行定量操作，現報道如下。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑人重組IL-6蛋白(美國Fitzgerald公司)；IL-6抗體A1、IL-6抗體A2、膠乳封閉液、膠乳保存液、噴墊工作液、樣本稀釋(廣州萬孚生物技術有限公司)；IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α、干擾素γ(英國Abcam公司)；小牛血清(美國Sigma公司)；熒光微球(美國Bangslab公司)；玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)。噴膜機(Iso Flow型，美國Biodot公司)；噴墊機(HGS510，杭州峰航科技有限公司)；切條機(HGS201，杭州峰航科技有限公司)；熒光定量檢測儀(飛測Ⅱ，廣州萬孚生物技術股份有限公司)；超純水機(Milli-Q，美國Millipore公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG-9123A型，上海森信試驗儀器有限公司)。

1.2試驗原理本試驗采用雙抗夾心法定量檢測血清中IL-6水平。將待測血清和樣本稀釋液按照一定比例混合后加入加樣孔中，血清中的IL-6抗原會和樣品墊上的熒光標記IL-6抗體結合形成復合物，并通過層析作用逐漸在硝酸纖維素膜(NC膜)上移動到固定在NC膜上檢測區(T線)的包被IL-6抗體結合，質控區(C線)的抗體也會和熒光膠乳中的物質結合。當檢測卡插入熒光檢測儀后，儀器會自動讀取檢測卡上T線和C線的熒光信號強度，通過T/C熒光信號強度則可計算出待測血清中IL-6的水平。

1.3方法

1.3.1試劑卡制備將IL-6抗體和羊抗兔IgG噴于包被膜的T線和C線上，兩帶間隔4 mm，置于50 ℃的干燥箱中干燥48 h。將制備的免疫熒光膠乳和標記熒光微球的兔IgG工作液稀釋后用噴墊機進行噴墊，置于的50 ℃烘箱中干燥24 h，密封保存。用切條機得到寬度為4 mm的試紙條，將試紙條裝入特定的塑料檢測卡中，用壓卡機壓緊檢測卡上下蓋，后置于干燥房待用。

1.3.2樣本檢測檢測在室溫下進行，取75 μL血清樣本，與100 μL實驗室研制的樣本稀釋液充分混勻1 min，取75 μL的混合液加入試劑卡中，層析反應15 min后將檢測卡插入熒光定量檢測儀中，讀取熒光信號T、C值，計算出相應的T/C，T/C越高則樣本中IL-6水平越高。

1.3.3熒光免疫層析試紙條性能評價

1.3.3.1標準曲線的建立取8個配制的標準品水平點，平行測定10次，檢測低、中、高水平的標準品在試紙卡的熒光信號T/C。標準品水平的對數值為變量，對應檢測的熒光信號T/C為因變量，構建擬合計算方程式，并繪制確定最終的標準曲線。

1.3.3.2靈敏度試驗對確定的20份陰性血清樣本進行測試，重復測定6次。檢測限(LOD)等于標準曲反求值的平均值加上3倍標準偏差。定量限(LOQ)等于標準曲線反求水平的平均值加上10倍的標準偏差。

1.3.3.3添加回收試驗配制IL-6水平分別為10.00、500.00、1 000.00 pg/mL的標準品，重復檢測6次。根據測得的熒光定量信號T/C，標準曲線反求出待測樣本的水平。添加回收率越接近100.00%則表示檢測方法越準確。

1.3.3.4精密度試驗本試驗用同一批試紙條檢測批內的精密度，再選用3種不同批次的試紙條進行不同批次間的批間精密度試驗，每個水平點重復測定10次。計算出每個水平點的平均變異系數(CV)值，對批次內的精密度和批間內的精密度進行分析。

1.3.3.5特異性試驗本試驗將一定量的IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α、干擾素γ添加到陰性小牛血清中，分別配制成水平為10 000.00 pg/mL的競爭物標準溶液，重復測定6次，計算出每個競爭物的交叉反應率。交叉反應率(%)=(S/Z)×100% (S表示抗原類似物用試劑卡測定的水平，Z表示抗原類似物添加的水平)。

1.3.3.6穩定性試驗將試劑卡在50 ℃烘箱中分別放置7、14、21、30 d后取出放入干燥房內，與干燥房內常溫放置的試劑卡進行對比，如穩定性不變則相當于試劑卡可以常溫保存1年，樣本稀釋液使用4 ℃保存，檢測試劑卡的穩定性。

1.3.3.7臨床樣本檢測取廣州中山大學附屬第三醫院嶺南醫院、廣東省第二人民醫院日常檢測臨床樣本,選取臨床樣本共計100例，患者的血清用的是SIEMENSIMMULITE1000儀器檢測。在實驗室用研制的同批次IL-6熒光定量免疫層析試劑卡進行檢測，并對其檢測值進行線性回歸分析。

2　結　　果

2.1標準曲線的建立用制備的標準品0.00、20.00、44.00、85.00、161.00、385.00、500.00、842.00 pg/mL按1.3.3.4中的步驟加入試劑卡中，每個水平點平行測定10次。用熒光定量檢測儀測定每張試劑卡的熒光信號T/C，用標準品水平的對數值作為X軸，對應的熒光信號平均T/C作為Y軸。其中標準曲線方程為：Y=0.731+1.246X-1.561X2+0.564X3，r2=0.965，線性關系良好。

2.2靈敏度試驗結果對20份確定的陰性血清樣本進行檢測，標準曲線反求檢測結果的平均值為1.30 pg/mL，標準偏差為2.40，因此，LOD值為8.49 pg/mL，大于則判定為陽性，低于則判為陰性。LOQ值為25.28 pg/mL。因此，本試驗研究試劑盒的檢測范圍為8.49～848.00 pg/mL。

2.3添加回收試驗結果本試驗用添加回收試驗測定IL-6熒光定量試劑卡的檢測準確性，當回收率越接近100.00%，說明此試劑卡檢測越準確。在10.00、500.00、1 000.00 pg/mL水平點包含低、中、高的水平范圍內進行添加回收試驗，在10.00 pg/mL的回收率平均值為96.51%，CV為9.60%；在500.00 pg/mL的回收率平均值為102.46%，CV為8.57%；在1 000.00 pg/mL的回收率平均值為103.06%，CV為2.59%。

2.4精密度試驗結果批內精密度結果見表1，批內各水平點T/C的CV范圍為4.07%～7.72%。3批次混合后測得的批間精密度結果見表2，批間各水平點T/C的CV為3.86%～6.70%。同一批次的批內和3個批次的批間的CV均小于15.00%。

表1　　批內精密度試驗結果(n=10)

表2　　批間精密度試驗結果(n=10)

2.5特異性試驗結果IL-6熒光定量免疫層析試劑盒對待測水平為10.00 pg/mL的競爭物IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α、干擾素γ進行檢測，結果表明競爭物IL-4、TNF-α、干擾素γ在試驗中并未檢測到；IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-8的交叉反應率均小于0.10%。

2.6穩定性試驗結果熒光定量免疫層析試劑卡的穩定性見圖1，試劑卡放在50 ℃烘箱中加速破壞1、2、3、4周在標準品測試的情況下的反應曲線與常溫保存的試劑卡基本吻合，低、中、高水平的熒光信號T/C基本沒變化。

圖1　　IL-6熒光定量免疫層析試劑卡穩定性

2.7臨床樣本檢測結果將100份血清臨床樣本分別在SIEMENS IMMULITE1000 IL-6試劑盒與研制的IL-6熒光定量免疫層析試劑盒中進行測定，見圖2。其中相關方程為Y=0.657X-10.048，r2=0.965，Y表示SIEMENS IMMULITE1000 IL-6試劑盒測定的臨床水平值，X表示IL-6熒光定量免疫層析試劑盒測定的臨床水平值，回歸方程中r2=0.965，實驗室研制IL-6試劑盒與化學發光試劑盒的r2>0.950 0。

圖2　　　　　IL-6熒光定量免疫層析法與

3　討　　論

目前在市面還沒有相應的IL-6熒光定量免疫層析試劑盒的開發，因此，研究IL-6熒光定量免疫層析試劑盒具有重要意義。目前通常市場上檢測IL-6的常用檢測方法儀器成本較高，耗費時間較長、操作麻煩。因此，可以進一步建立用于商業用途的IL-6熒光定量免疫層析試劑盒。

本試驗研制的IL-6熒光定量免疫層析試劑卡的定量反應曲線線性與化學發光法相關性良好，r2=0.965，說明標準曲線線性關系、精密度良好，LOD為8.49 pg/mL，LOQ為25.28 pg/mL，對10.00、500.00、1 000.00 pg/mL水平進行添加回收試驗，測得其回收率平均值分別為96.51%、102.46%，103.06%，批內以及批間的精密度均小于15.00%，試紙條和7種競爭物沒有交叉反應，說明準確性、特異性均良好，試紙條的穩定性良好。試劑卡放在50 ℃烘箱中加速破壞1、2、3、4周在標準品測試的情況下的反應曲線與常溫保存的試劑卡基本吻合，低、中、高水平的熒光信號T/C基本沒變化。說明熒光定量免疫層析試劑卡經加速破壞測試后，穩定性良好，可以常溫放置1年。

因此，本試驗研制的IL-6熒光免疫層析試劑盒可以快速、定量地檢測血清中的IL-6水平，然而目前該方法仍處于研究階段，還需要進一步的研究實現商業化。

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