金黃連口服液對雞呼吸道致病菌的抑菌作用研究

李瑞娟，梁 娜，馮 芳，王小娜

（河北新華科極獸藥集團有限公司，河北石家莊051430）

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試菌珠：雞源性大腸桿菌標準菌種（O78）、副雞嗜血桿菌，均購自中國獸醫藥品監察所；雞毒支原體標準株S6（華南農業大學獸醫學院）

1.1.2藥品與試劑：金黃連口服液 （河北新華科極獸藥集團），由連翹、蒲公英、黃芩、金銀花、板藍根，購自安國藥材批發市場；魚腥草口服液（河北新華科極獸藥集團）；營養瓊脂（北京陸橋技術有限公司）；營養肉湯（北京陸橋技術有限公司）。

1.1.3儀器與設備：恒溫培養箱（上海一恒科技儀器有限公司）、超凈工作臺（蘇州蘇凈集團空氣技術有限公司）等。

1.2　方法

1.2.1金黃連口服液的制備

由連翹、蒲公英、黃芩、金銀花、板藍根5種中藥組成，連翹蒸餾提取揮發性物質，收集揮發性物質，備用；蒸餾后的水溶液另器收集；藥渣與其余蒲公英等四味加水煎煮1.5h，煎液濾過，濾液備用；藥渣加水再煎煮1.0h，煎液濾過，濾液與上述兩種水溶液合并，減壓濃縮至一定體積，冷至40℃時加入乙醇，使含醇量達75%，充分攪拌，靜置12h，濾取上清液，殘渣加75%乙醇適量，攪勻，靜置12h，濾過，合并乙醇液，回收乙醇至無醇味，加入連翹蒸餾液再加水制成，分裝，置于4℃冰箱保存，備用。

1.2.2菌種準備

大腸桿菌O78、副雞嗜血桿菌，將試驗菌種分別接種于普通營養瓊脂及雞血清肉湯瓊脂培養基，37℃培養18h，然后挑取普通營養瓊脂平板上的純培養典型菌落于3mL生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁，調整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。

雞毒支原體S6株，將適量改良Frey氏培養液加入冷凍保存的菌種中，使凍干菌種復水。混勻后將混合物移植于5mL改良Frey氏液體培養基中，置于37℃5%～10%CO2和相對濕度為80%～90%的培養箱中培養。4～5d后培養基顏色變橙黃色或黃色，再傳2代，測定顏色變化單位（108ccu/mL）并稀釋至104ccu/mL作為本試驗用菌液。

1.2.3藥物敏感性試驗

先于無菌平皿內加入20mL適宜的瓊脂作底層，再用培養16～18h的目標菌液2mL與18mL的適宜瓊脂混合均勻作上層，凝固后用直徑為1cm的打孔器在培養基上等距離打孔6個，孔徑大小、深度保持均勻，于孔中加滿濃度為1g/mL的供試藥液，置于37℃恒溫培養箱中培養24h，（雞毒支原體標準株S6、副雞嗜血桿菌需封閉培養皿置于37℃含5%～10%CO2培養箱培養7～10d）測量抑菌圈直徑，每種藥液做3次重復，求平均值，每種菌均按照此方法進行試驗。

抑菌結果判定方法：抑菌效果按《中藥藥理學》中的標準判定，抑菌直徑＞20mm 為極敏記為（++++），15～19mm 為高敏，記為（+++）；10～14mm 為中敏， 記為 （++）；10mm 以下為低敏， 記為（+）；“—”表示無抑菌作用。

1.2.4藥物最小抑菌濃度（MIC）試驗

取13×100mm滅菌試管11支并編號，每管加入無菌肉湯培養基2mL，然后于第1管中加入受試中藥口服液2mL，混勻后取出2mL加入第2管中，以此類推，直到第9管中取出2mL棄去，第10管不加藥液作陽性對照，第11管加入受試藥液2mL，混勻后取2mL棄去，不加細菌作陰性對照。然后向3個組的兩種藥液的每個稀釋度分別加入大腸桿菌O78、雞毒支原體標準株S6、副雞嗜血桿菌懸液0.1mL，搖勻，放入37℃恒溫培養箱中培養24h， 第 1～9 管藥物濃度分別為 500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.8、3.9、2.0mg/mL。以不發生混濁變化的最高藥物稀釋倍數為該藥物的最低藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC），根據MIC值來評價中藥的體外抑菌活性[1-3]。

2　結果

2.1　金黃連口服液對各試驗菌株的抑菌圈直徑的影響

金黃連口服液對引起雞呼吸道疾病3種主要致病菌的抑菌效果見表2-1。結果顯示，金黃連口服液對大腸桿菌O78型、副雞嗜血桿菌、雞毒支原體標準株S6株均表現出中等強度的抑菌活性，其抑菌直徑分別為13.1mm、12.6mm、14.3mm，優于對照藥物魚腥草口服液（10.4mm、9.2mm、10.5mm）的抑制效果。表明，金黃連口服液對多種雞呼吸道致病菌有一定程度的抵抗作用。

2.2　金黃連口服液的最小抑菌濃度測定結果

金黃連口服液最小抑菌濃度測定結果見表2-2。結果顯示，金黃連口服液對大腸桿菌O78型、副雞嗜血桿菌、雞毒支原體標準株 S6的最小抑菌濃度 MIC值為 62.5mg/mL、125.0mg/mL、62.50mg/mL，較 魚 腥 草 口 服 液 （250.0mg/mL、125.0mg/mL、125.0mg/mL）作用明顯。

3　分析與討論

大腸桿菌、副雞嗜血桿菌等細菌為臨床上常見致病菌，將金黃連口服液和魚腥草口服液對致病菌進行抑菌活性研究對防治由這些細菌引起的感染具有重要意義。本試驗通過采用藥物敏感性試驗的打孔法及最小抑菌濃度試驗的試管二倍稀釋法研究了金黃連口服液的體外抑菌作用。結果顯示，金黃連口服液對大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、支原體均表現出一定的抑制作用，且抑制效果強于魚腥草口服液對照組，這與田樂，楊紅文等的報道結果相似[4-5]。表明，金黃連口服液可作為一種良好的臨床抗菌藥，具有較強的產品開發價值。

據報道，金黃連口服液方劑中各味藥均具有明顯的抗菌作用，君藥連翹中的有效成分異連翹酯苷和連翹酯苷均有較強的抑菌能力，是連翹中極有前景的植物抗菌活性成分，對多種革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有明顯的抑制作用。臣藥蒲公英具有廣譜抑菌活性，采用微量肉湯稀釋法進行體外的抑菌實驗研究，發現蒲公英對葡萄球菌屬細菌、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌、腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、流感嗜血桿菌等常見臨床分離細菌有明顯的抗菌活性。體外研究發現，黃芩生品及炮制品對痢疾桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌有效。佐藥金銀花為作用較強的廣譜抗菌中藥，對金黃色葡萄糖球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌和變形桿菌等有抑菌作用。板藍根對革蘭陽性和陰性桿菌亦有一定的抑制作用，其抑菌的有效成分為色胺酮和一些化學結構尚未闡明的吲哚類衍生物[6-8]。

4　結論

金黃連口服液對臨床常見呼吸道致病菌具有明顯的抑制作用，其效果優于魚腥草口服液。

注:同行數據后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

表2-1　金黃連口服液及魚腥草口服液對3種主要致病菌的抑菌作用

表2-2　金黃連口服液及魚腥草口服液最小抑菌濃度（m g/m L）

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