鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗生產工藝的研究

2018-04-16 01:11:01何平有楊保收鄒立宏邱貞娜郁宏偉趙玉龍

今日畜牧獸醫 2018年3期

何平有，劉濤，楊保收，林建，鄒立宏，邱貞娜，郁宏偉、2，趙玉龍，劉浩

（1.瑞普（保定）生物藥業有限公司，071000；2.天津瑞普生物技術股份有限公司，300308；3.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，100097）

鴨坦布蘇病毒病(DTMUV)是鴨坦布蘇病毒病的病原，引起不同日齡的北京鴨、櫻桃谷鴨、金定鴨和麻鴨等發病，主要表現為精神沉郁、產蛋下降和死淘率增加，給養鴨業造成了嚴重經濟損失。在DTMUV的疫苗研究中，近年來有利用禽胚及其成纖維細胞、傳代細胞等培養病毒的報道[1]，但受病毒株系差別、培養體系等因素影響，其增殖條件和疫苗效果差異比較大。筆者為提高DTMUV HB株疫苗的生產效率和產品品質，對HB株細胞適應毒在鴨胚成纖維細胞上的增殖條件進行篩選，擬確定該疫苗的最佳生產工藝。

1　材料

1.1　毒種

鴨坦布蘇病毒HB株F4代細胞適應毒由瑞普公司質量管理部提供。

1.2　細胞

購自河北省未感染坦布蘇病毒健康鴨群所產種蛋，自行孵化至適宜日齡備用，制成成纖維單層細胞。

1.3　培養基

DMEM培養基和新生牛血清均購自Gibco公司。

2　方法

2.1　最佳接毒比例的確定

分別按0.25%、0.5%、1.0%和2.0%的比例將毒種接入致密鴨胚成纖維單層細胞，每個比例接種3瓶，補加含2%新生牛血清的DMEM液，置37℃含5%CO2的培養箱中培養，逐日觀察細胞病變（CPE），當CPE達到75%～80%時收獲病毒懸液。將收獲的病毒液分別取3個適宜的稀釋度按中國獸藥典方法測定其病毒含量[2]。

2.2　最佳收獲時間的確定

按2.1優選的接毒比例分別接種鴨胚成纖維單層數瓶，于接毒后72、78、84、90和96h，每個時間點分別隨機取出2瓶，重復3次。按2.1的方法測定病毒含量。

3　結果與討論

3.1　最佳接毒比例的確定

結果詳見表1。由表1可見，4個接毒比例以0.5%接毒比例收獲的病毒液病毒含量最高，均不低于106.7TCID50/0.1m l，1%接毒比例次之，0.25%和2%接比例量最差。因此，最佳接毒比例為0.5%。

3.2　最佳收獲時間的確定

結果詳見表2。由表2可見，隨著收獲時間的延長，收獲病毒液的病毒含量呈一個先上升后下降的趨勢；其中接毒后84小時病毒含量最高，三批次毒液病毒含量均不低于107.1TCID50/0.1m l；其次是接毒后78h收獲的病毒液，三批次病毒含量在106.5～106.9TCID50/0.1m l。

4　討論

本研究成功實現鴨坦布蘇病毒培養從組織培養向細胞培養的轉變，在實驗室前期細胞適應株DTMUV HB株的基礎上，對不同接毒比例和收獲時間進行優化，為進一步完善該疫苗株的生產工藝提供技術支持。

從不同接毒比例看，當接毒比例從0.25%提升至0.5%時收獲病毒液的病毒含量，從105.9～106.1TCID50/0.1ml提升到106.7TCID50/0.1ml以上，而后隨著接毒比例上升，出現病毒含量下降。因此，接毒比例并不是簡單的越高越好，它們之間存在一個最適合的比例，本研究的最佳接毒比例為0.5%。

從不同收獲時間看，當收獲時間從接毒后72小時至84小時，收獲毒液的病毒含量從106.1～106.3TCID50/0.1ml提升到107.1TCID50/0.1ml以上，而后隨著收獲時間延長，出現病毒含量下降的情況。這可能與鴨坦布蘇病毒的特性相關，收獲時間早病毒增殖尚未達到繁殖高峰；隨著時間延長而增加，收獲高于84小時，病毒繁殖達高峰后大量病毒暴露在高溫環境中失活而導致病毒含量下降。