八角茴香揮發油超聲輔助提取及抗氧化性研究

謝志新，陳琳琳，張文州，William Chandler

(1.泉州醫學高等專科學校 藥學院，福建 泉州　362000；2.美國泰森食品有限公司，上海　200021)

八角茴香，別名八角大茴、大八角、大茴香等，系木蘭科八角屬植物八角茴香的干燥成熟果實，主要分布在廣西、云南等省份，為我國的特產辛香料和中藥[1]。八角茴香富含揮發油、糖苷類、黃酮類、莽草酸等多種天然活性成分，其中揮發油含量最高，約占5%～8%[2]，八角茴香揮發油氣味芳香持久、味甜，常作為辛香料廣泛用于牙膏、香皂、甜香酒等行業，是食品行業、化學工業的重要原料。中醫理論認為八角茴香油具有溫陽散寒、理氣止痛的功效，用于治療寒疝腹痛、腎虛腰痛等。近年來有研究表明八角茴香還具有廣譜的抗菌作用，抗疲勞、抗氧化等功效[3-6]。因此，八角茴香揮發油還可作為抑菌劑用于醫學或制藥行業，也可作為天然保鮮劑廣泛用于食品保鮮，避免被氧化變質[7]。

目前，國內外八角茴香油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法[8]、超臨界CO2提取法[9]、溶劑萃取法[10]、超聲波輔助萃取法等[11]，不同的提取方法得到的揮發油產率和質量都不一樣。由于水蒸氣蒸餾法提取時間長、提取率低，而超臨界CO2萃取法也由于設備昂貴、生產成本高導致其工業化的應用受限。超聲波輔助提取法由于超聲波可加速中藥有效成分的溶解、擴散，具有操作簡單、提取率高和提取時間短等優點；同時在整個提取過程中溫度升高不顯著，從而能更好地保持揮發油特有的風味[12,13]。因此，本實驗選取超聲波輔助乙醇提取法進行研究，以料液比、粉碎粒徑、超聲時間3個因素進行正交優化試驗，以獲得提取揮發油的最佳工藝參數，同時測定其對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除能力，并與維生素C標準品作對照，研究其體外的抗氧化活性，從而使八角茴香應用價值得到更有效的利用。

1　材料與儀器

1.1　材料

八角茴香：購于泉州市東南醫藥連鎖公司，經泉州醫學高等專科學校生物學專業黃秀珍教授鑒定。

1.2　主要儀器和試劑

1.2.1儀器

FA2004電子分析天平上海良平儀器儀表有限公司；VCX500超聲波細胞破碎儀美國SONICS公司；DK450B恒溫水浴箱上海森信實驗儀器有限公司；DXF-20D高速萬能粉碎機廣州大祥電子機械設備公司；DHG-9140A鼓風干燥箱上海一恒科學儀器公司；752紫外可見分光光度計上海光譜儀器廠。

1.2.2試劑

95%乙醇冰乙酸(AR，西隴化工有限公司)；維生素C標準品(上海江萊生物科技公司)；羥自由基測試盒、抗超氧陰離子自由基測試盒(南京建成生物研究所)；DPPH(BR，Sigma公司)。

2　試驗方法

2.1　單因素試驗

2.1.1料液比因素的考察

將八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過60目藥篩，精確稱取未浸泡和超聲處理的藥材粉末10.000 g，共5份，裝入濾紙筒中，搭好索氏提取裝置，分別加入1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的95%乙醇，用電熱套加熱30 min，收集乙醇提取液，濃縮得八角茴香揮發油，稱重并計算提取率,提取率(%)=m1/M2×100。式中：m1為八角茴香揮發油質量(g)，M2為八角茴香藥材粉末質量(g)。

2.1.2粉碎度因素的考察

在已經確定的最佳料液比基礎上，將八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，分別過20，40，60，80，100目的藥篩，精確稱取未浸泡和超聲處理的藥材粉末10.000 g，共5份，分別裝入濾紙筒中，搭好索氏提取裝置，按1∶20的料液比加入95%乙醇，用電熱套加熱30 min，收集乙醇提取液，濃縮得八角茴香揮發油，稱重并計算提取率,提取率(%)=m1/M2×100%。式中：m1為八角茴香揮發油質量(g)，M2為八角茴香藥材粉末質量(g)。

2.1.3超聲時間因素的考察

在已經確定的最佳料液比、最佳粉碎粒徑基礎上，將八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，藥篩，精確稱取未浸泡的藥材粉末10.000 g，共5份，分別裝入密閉容器中，加入約100 mL的95%乙醇，置于超聲波細胞破碎儀上超聲，功率為200 W，時間分別為10，20，30，40，50 min，之后分別裝入濾紙筒中，搭好索氏提取裝置，按1∶20的料液比加入95%乙醇，用電熱套加熱30 min，收集乙醇提取液，濃縮得八角茴香揮發油，稱重并計算提取率，提取率(%)=m1/M2×100。式中：m1為八角茴香揮發油質量(g)，M2為八角茴香藥材粉末質量(g)。

2.2　測定方法

2.2.1羥自由基清除率的測定[14]

利用羥自由基測定試劑盒，利用Fenton反應體系，采用分光光度法對羥自由基清除率進行測定，清除率(%)=(A對照-A樣品)/A對照×100。式中：A對照為底物應用液的吸光度， A樣品為樣品試驗組的吸光度。

2.2.2超氧陰離子自由基清除率的測定

利用抗超氧陰離子自由基測試盒，利用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應系統，采用分光光度法對超氧陰離子自由基清除率進行測定，清除率(%)=(A對照-A樣品)/A對照×100。式中：A對照為蒸餾水及試劑應用液的吸光度，A樣品為樣品試驗組的吸光度。

2.2.3DPPH自由基清除率的測定

參考Capek等[15]的試驗方法并進行適當改進， DPPH自由基清除率=[1-(As-Ab)/Ac]×100。式中：As為樣液試驗組的吸光度，Ab為樣液本底組的吸光度，Ac為空白對照組的吸光度。

2.2.4試驗數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2007等軟件進行數據處理與統計分析。

3　試驗結果與分析

3.1　八角茴香揮發油提取單因素試驗結果

3.1.1料液比對揮發油提取率的影響

表1　料液比因素考察結果Table 1 The solid-liquid ratio factor investigation results

由表1可知，隨著料液比的增加，提取率呈上升趨勢，在1∶20時揮發油提取率達到最高，當料液比再增加時提取率不升反降。因此，綜合考慮提取效果和溶劑用量選擇料液比為1∶20。

3.1.2粉碎粒徑對揮發油提取率的影響

表2　粉碎粒徑因素考察結果Table 2 The crushing particle size factor investigation results

由表2可知，揮發油的提取率并不是隨著粉碎粒徑的增加而升高，即藥材并不是粉碎得越細越好，而是粉碎到能過60目藥篩時達到高峰，這主要是因為藥材粉碎過細可導致油室或油細胞破碎過多，在粉碎過程中造成揮發油的損失。因此揮發油提取的最佳藥材粉碎粒徑為60目。

3.1.3超聲時間對揮發油提取率的影響

表3　超聲時間因素考察結果Table 3 The ultrasonic time factor investigation results

由表3可知，揮發油的提取率在超聲30 min時達到高峰，隨著超聲時間的延長，提取率時高時低，但均未超過30 min時的高峰值。因此揮發油提取的最佳超聲時間為30 min。

3.1.4超聲波輔助提取揮發油的工藝優化

根據料液比、粉碎粒徑、超聲時間單因素的試驗結果，選取3個水平，進行正交試驗設計，正交試驗因素水平表及試驗結果分別見表4和表5，以提取率為考察指標，研究各因素對提取率的影響，從而確定最佳提取工藝參數。

表4　超聲波輔助法提取因素水平表Table 4 The factors and levels of ultrasonic-assisted extraction method

表5　超聲波輔助提取法正交試驗設計與結果Table 5 The orthogonal experiment design and results of ultrasonic-assisted extraction method

由表5可知，極差RA>RB>RC，即各因素對揮發油提取的影響程度為藥材的料液比>粉碎粒徑>超聲時間；再通過K值的比較分析可知：KA1>KA3>KA2，KB2>KB1>KB3，KC2>KC3>KC1，即A1B2C2是揮發油提取的最優組合。因此，基于以上的分析可確定超聲波輔助乙醇提取法的最佳提取工藝條件為料液比1∶15、粉碎粒徑60目、超聲時間30 min、提取率28.501%，得到的揮發油為淺褐色的膏狀物，略帶粘稠，具有八角茴香芳香氣味。

按正交試驗表所得的最佳提取工藝條件，平行提取3次，提取率分別為28.316%，28.487%，28.512%，均值為(28.438±0.11)%。

3.2　清除羥自由基的能力

圖1　維生素C標準品與八角茴香揮發油對羥自由基的清除能力Fig.1 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to hydroxyl free radical

由圖1可知，八角茴香揮發油和維生素C標準品對羥自由基均有較好的清除效果，且清除能力隨著濃度的增加而逐漸加強，同時在一定濃度范圍內具有良好的線性關系，線性方程分別為y=3.7119x+31.655，R2=0.9818；y=316.99x+43.496，R2=0.9924，其半數清除率IC50分別為4.9422，0.0205 mg/mL，當八角茴香揮發油濃度為12.00 mg/mL時清除率與維生素C標準品0.12 mg/mL的清除率相當，可達78.56%。羥自由基是高反應性的自由基，其反應距離短、速度快、攻擊力強，是組織細胞衰老、炎癥、心腦血管疾病的重要誘導因素之一。八角茴香揮發油對羥自由基的高清除效果能起到很好的抗氧化、抗炎作用。

3.3　清除超氧陰離子自由基的能力

圖2　維生素C標準品與八角茴香揮發油對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.2 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to superoxide anion free radical

由圖2可知，八角茴香揮發油和維生素C標準品對超氧陰離子自由基的清除能力隨著濃度的增加而呈上升趨勢，在測定的濃度范圍內兩者均有較好的線性關系，線性方程分別為y=4.7792x+12.487，R2=0.9914；y=164.3x+10.058，R2=0.9934，其IC50分別為7.8492，0.2408 mg/mL。超氧陰離子自由基本身雖不直接誘導生物和食品體系的脂類氧化，但可以通過連鎖反應產生高活性的羥自由基，因此，通過對超氧陰離子自由基的清除也能達到抗氧化作用。

3.4　清除DPPH自由基的能力

圖3　維生素C標準品與八角茴香揮發油DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to DPPH free radical

由圖3可知，八角茴香揮發油和維生素C標準品對DPPH自由基也表現出一定的清除能力，但是清除效果均不理想，八角茴香揮發油濃度為6.00 mg/mL時清除率與維生素C標準品0.200 mg/mL的清除率相當，僅為49.46%左右；在低濃度范圍內八角茴香揮發油的清除效果甚至優于維生素C標準品。在測定濃度間兩者均具有明顯的劑量效應，線性方程分別為y=4.5894x+21.555，R2=0.9914；y=187.46x+7.8784，R2=0.9897其IC50分別為6.1980，0.2247 mg/mL。

3.5　八角茴香揮發油與維生素C標準品的抗氧化性比較

圖4　八角茴香揮發油與維生素C標準品對自由基半數清除率的對比圖Fig.4 The comparison of IC50 of star anise volatile oil and vitamin C standard

由圖4可知，通過比較八角茴香揮發油及維生素C標準品對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的IC50，八角茴香揮發油雖然對各種自由基均有較好的清除作用，但是其IC50均低于維生素C標準品，這可能跟揮發油未經過分離純化，里面含有一些沒有抗氧化活性的物資有關，如果經過純化后，可能表現出更好的抗氧化效果。通過比較IC50可知，八角茴香揮發油對3種自由基的清除能力大小依次為羥自由基>DPPH自由基>超氧陰離子自由基。

4　結論

超聲波輔助法的最佳提取工藝參數為料液比1∶15、粉碎粒徑60目、超聲時間30 min、提取率(28.438±0.11)%，所得到的揮發油為淺褐色的膏狀物，略帶粘稠，味濃厚。八角茴香油是重要的藥食同源物資原料，在醫藥、化工及食品加工等領域具有廣泛的應用前景，因此其提取工藝及優化也將受到人們更多的關注。由于中藥材的提取受到諸多因素的影響，如藥材與溶劑的比例(即料液比)、藥材粉碎粒徑、浸泡時間、提取時間、溫度和提取工藝等。因此加強這些方面的研究，可以對其有效成分進行更好的提取、分離、純化，從而提高揮發油的純度。

八角茴香揮發油在測定濃度范圍內對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基均具有良好的清除作用，且其清除能力與樣品的濃度呈現明顯的劑量-效應關系。趙秀玲[16]的研究表明八角茴香油的抗氧化性可能與大茴香醛、大茴香腦有關，提取物可能通過清除油脂氧化反應生成的自由基來抑制鏈式反應以實現抗氧化作用。本試驗僅是從體外通過IC50來初步判斷八角茴香揮發油對3種自由基的清除能力，結果表明均具有一定的清除效果，而自由基的清除是抗氧化劑發揮抗氧化作用的主要機制[17]。因此，八角茴香可作為一種較好的天然抗氧化劑、抑菌劑和保鮮劑的重要原料。今后將加強其在抗氧化、抑菌作用等方面的研究，從而為八角茴香的深加工和系列產品的開發提供一定的理論基礎，最終提高產品的附加值。

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