高效液相色譜法同時測定清熱護肝方中葛根素、梔子苷和芍藥苷的含量*

樓婷婷 余 平 孫萍萍 余永華

1 浙江省立同德醫院 浙江 杭州 310012

2 杭州新諾華醫藥有限公司 浙江 杭州 310015

清熱護肝方由葛根、梔子、芍藥、柴胡、枸杞、茵陳、五味子、板藍根、垂盆草、紫草組成，具有清熱解毒、保肝護肝的功效。其中葛根、梔子、芍藥是其重要成分。目前，未見同時測定清熱護肝方多個成分含量的報道。筆者采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定清熱護肝方葛根中活性成分葛根素、梔子中活性成分梔子苷和芍藥中活性成分芍藥苷的含量，并進行方法學考察，以期為有效控制該制劑的質量提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-15C高效液相色譜儀；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（德國塞多利斯）。葛根素、梔子苷和芍藥苷的對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200511、110749-200714、110736-201337）；水 為 過0.22μm濾膜的純水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析醇。清熱護肝方飲片均由浙江中醫藥大學中藥飲片廠提供，經浙江中醫藥大學藥學院專家鑒定合格。

2 方法[1-4]和結果

2.1 色譜條件：流動相為乙腈-水（16∶84），色譜柱為HypersilBDSC18（4.6mm× 250mm，5μm），流 速 為1.0ml/min，檢測波長為230nm。進樣量為20μl。理論板數按葛根素、梔子苷和芍藥苷計算均在4000以上，分離度均＞1.5。對照品、樣品、陰性樣品色譜見圖1。

2.2 對照品溶液的制備：分別取葛根素對照品約17mg、梔子苷對照品約10mg和芍藥苷約14mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備：按照處方，調配混合研細，精密稱取細粉適量約500mg，置50ml容量瓶中，加甲醇25ml，超聲提取40min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液即得。

圖1 對照品(A)、樣品(B)、陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.4 陰性對照溶液的制備：以相同處方比例，制得不含葛根、梔子、芍藥的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成空白對照溶液。

2.5 線性關系考察：分別精密量取濃度為170μg/ml的葛根素對照品溶液、100μg/ml的梔子苷對照品溶液、140μg/ml的芍藥苷對照品溶液適量，加甲醇配成濃度為 0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012μg/ml的系列葛根素對照品溶液，0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006μg/ml的系列梔子苷對照品溶液，0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008μg/ml 的系列芍藥苷對照品溶液。按上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得線性方程：Y=2109500X+15080，r=0.9999；Y=29589000X-72694，r=0.9998；Y=1976500X-5798，r=0.9999。結果表明葛根素在0.002～0.012μg/ml，梔子苷在0.001～0.006μg/ml，芍藥苷在0.003～0.008μg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.6 穩定性實驗：取供試品溶液，按色譜條件，分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h進行測定，計算供試品溶液葛根素、梔子苷和芍藥苷的峰面積RSD。得葛根素、梔子苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.70%，0.93%，1.05%，表明樣品溶液在12h內穩定。

2.7 精密度試驗：精密吸取對照品溶液，重復進樣6次，測定峰面積，計算RSD。得葛根素、梔子苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.44%，0.61%，0.89%（n=6），結果表明本法精密度良好。

2.8 重復性試驗：稱取同一批次樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試液并依法測定，實驗結果顯示葛根素、梔子苷和芍藥苷含量的RSD分別為1.61%，1.79%，1.47%（n=6），結果表明重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗：取已知含量的清熱護肝方（含葛根素0.685mg/g、梔子苷0.396mg/g和芍藥苷0.548mg/g）樣品適量，研細，取9份，每份約250mg，置50ml量瓶中，精密加入對照品溶液1ml，加甲醇22ml，超聲處理40min，放冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，按上述色譜條件測定，計算回收率，結果見表1～表3。

表1 葛根素加樣回收率測定結果（n=9）

表2 梔子苷加樣回收率測定結果（n=9）

表3 芍藥苷加樣回收率測定結果（n=9）

2.10 樣品的測定：按供試品溶液項下制備方法和色譜條件對3批樣品中葛根素、梔子苷和芍藥苷進行分析，計算含量，結果見表4。

表4 每片樣品中各成分含量測定結果（n=3）

3 討論

本法采用乙睛-水進行洗脫，簡便方便，基線平穩。分別對比例為13.5∶86.5、16∶84、17∶83進行考察，隨著乙睛比例的升高，保留時間縮短，但葛根素分離不完全，流動相的比例為16∶84時，分離效果較好。葛根素最大吸收波長為250nm，梔子苷最大吸收波長為240nm，芍藥苷最大吸收波長為230nm，梔子苷色譜峰面積比芍藥苷和葛根素大很多，在230nm處三個吸收峰均較好，兼顧三種成分的同時測定靈敏度，選擇230nm作為檢測波長。本文HPLC法同時測定清熱護肝方中葛根素、梔子苷和芍藥苷的含量方法可行，結果精密度高，重現性好，樣品回收率好，可為該制劑質量控制提供依據。

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