甘薯羽狀斑駁病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立

姜珊珊，馮佳，張眉，王升吉，辛志梅，吳斌，辛相啟

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甘薯羽狀斑駁病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立

姜珊珊，馮佳，張眉，王升吉，辛志梅，吳斌，辛相啟

（山東省農業科學院植物保護研究所植物病毒學實驗室，濟南 250100）

【】甘薯羽狀斑駁病毒（，SPFMV）侵染甘薯造成重要危害，本研究旨在利用反轉錄環介導等溫擴增技術（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）建立一種快速、高效檢測SPFMV的方法。【】從GenBank上獲得SPFMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因的核苷酸序列，利用Primer Explorer V4設計4條RT-LAMP特異性引物SPFMV-FIP（5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′）、SPFMV-BIP（5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′）、SPFMV-F3（5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′）和SPFMV-B3（5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′），同時設計2條反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）的特異性引物SPFMV-F（5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′）和SPFMV-R（5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′）。分別設置F3/B3﹕FIP/BIP引物濃度比（1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10），dNTPs濃度梯度（0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825 mmol·L-1），Betaine濃度梯度（0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1），反應溫度（59、61、63、65、67和69℃）和反應時間（20、30、40、50、60、70、80和90 min），對RT-LAMP反應體系各條件進行優化，確定最佳反應體系。通過測序及酶切對RT-LAMP產物進行鑒定。以攜帶SPFMV、甘薯C病毒（C，SPVC）、甘薯褪綠矮化病毒（，SPCSV）、甘薯病毒2（2，SPV2）、甘薯潛隱病毒（，SPLV）、甘薯G病毒（G，SPVG）、甘薯褪綠斑病毒（，SPCFV）和健康甘薯葉片的總RNA為模板，分別進行RT-LAMP和RT-PCR特異性檢測；帶有SPFMV的甘薯總RNA進行10倍梯度稀釋，以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀釋液為模板進行RT-LAMP和RT-PCR靈敏度測定。最后利用優化的RT-LAMP體系對山東省多地采集的SPFMV疑似病樣進行檢測，加入SYBR green I進行可視化檢測。【】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特異性檢測方法，優化的反應體系：引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP為0.8 μmol·L-1，SPFMV-F3/SPFMV-B3為0.2 μmol·L-1，dNTPs為0.325 mmol·L-1，Betaine為1 mol·L-1；65℃反應70 min。特異性試驗顯示本研究建立的RT-LAMP只對攜帶SPFMV的RNA能夠擴增出典型的梯狀條帶。RT-LAMP最低可檢測的RNA濃度為121.6×10-4ng·μL-1，而RT-PCR最低能檢測的RNA濃度為121.6×10-3ng·μL-1，表明RT-LAMP的靈敏度比RT-PCR高10倍。田間樣品檢測，RT-LAMP擴增結果與可視化檢測結果一致，表明本研究建立的RT-LAMP快速檢測方法可有效應用到SPFMV的田間檢測。【】建立的RT-LAMP快速檢測方法靈敏度高、特異性好，適用于SPFMV的田間快速檢測。

甘薯；甘薯羽狀斑駁病毒；反轉錄環介導等溫擴增技術；檢測

0 引言

【研究意義】甘薯（）是繼小麥、水稻、玉米、馬鈴薯、大麥和木薯之后的世界第七大糧食作物，同時也是重要的飼料和輕工業原料[1-3]。病毒病是威脅甘薯生產的重要病害，全世界因病毒病造成的甘薯損失每年高達30%—50%，在中國每年造成的經濟損失達40億元[4-5]。甘薯羽狀斑駁病毒（，SPFMV）是甘薯上的重要病毒，屬于馬鈴薯Y病毒屬（）成員，通過汁液或蚜蟲以非持久性方式傳播，在世界主要甘薯產區幾乎均有發現[6-8]。SPFMV可侵染甘薯等8種旋花科植物，在植株不同的生長時期表現的癥狀也不相同，嚴重危害甘薯的產量和品質[9]。近年來，SPFMV在中國多省（市）均有發生，且分布地區呈逐年擴展的趨勢[2-3,9]。因此建立一種簡單、快速的檢測方法對SPFMV的早期預警以及了解發病規律具有重要意義。【前人研究進展】2010年，張業輝等[10]建立了包括SPFMV在內的3種甘薯病毒的多重PCR檢測方法，隨后針對SPFMV的ELISA[11]、RT-PCR[2,11]、熒光定量RT-PCR[12-13]、反向斑點雜交[14]等檢測方法被逐步建立。筆者實驗室前期已通過生物學鑒定、電鏡觀察及RT-PCR等多種技術對山東地區的SPFMV等多種甘薯病毒進行了檢測[2]。以上幾種檢測方法均為了解SPFMV的田間發病情況提供了技術保證。反轉錄環介導等溫擴增技術（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是2000年由Notomi 開發的一種新型核酸擴增方法，該技術針對目的序列設計4條引物，特異性識別6個序列區，利用DNA鏈置換聚合酶（BstDNA polymerase）在60—65℃恒溫條件下進行高效擴增[15]。RT-LAMP已廣泛應用于人類[16-17]、動物[18-19]、植物[20-30]病原菌的檢測中，在糧食[20-22,27]、蔬菜[23-26]、果樹[28]以及經濟作物[29-30]的病毒病害檢測工作中發揮了重要作用。喬奇等[27]建立了針對甘薯褪綠矮化病毒（，SPCSV）的RT-LAMP檢測技術。迄今國內外還未見利用該技術檢測SPFMV的報道。【本研究切入點】現有RT-PCR和熒光定量PCR等分子檢測技術雖然已有高特異性和靈敏度的特點，但需要特定的儀器和專業的實驗人員來完成，不適用基層檢測。血清學檢測需要特異性抗血清，制作過程繁雜、成本昂貴，易出現假陽性。生物學鑒定和電鏡觀察費時費工，需要檢測樣品中病毒含量高。RT-LAMP作為一種新型的檢測技術，具有簡便、快速、特異等特點，不需要對模板進行熱變性，可在等溫條件下進行，短時間內即可獲得試驗結果[15]。基于此，本研究建立針對SPFMV的RT-LAMP快速檢測技術。【擬解決的關鍵問題】對SPFMV RT-LAMP檢測技術的各反應條件進行優化，驗證RT-LAMP擴增的特異性和靈敏度，建立一種SPFMV的新型、快速、靈敏的檢測技術，為甘薯病毒病害的監測防控提供技術支持。

1 材料與方法

試驗于2016年5月至2017年9月在山東省農業科學院植物保護研究所植物病毒學實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 植物材料 從山東臨沂地區甘薯苗床采集具有典型病毒病癥狀的甘薯樣品，種植于防蟲溫室中；經RT-PCR檢測確定甘薯病毒種類后，置于-80℃保存備用。選取經RT-PCR檢測不含病毒的甘薯脫毒苗作為陰性對照。

1.1.2 主要試劑 TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒、dNTPs購自北京全式金生物技術有限公司；HiScript?II 1st Stand cDNA Synthesis Kit購自諾唯贊生物公司；DL 2000 DNA Marker、M-MuLV反轉錄酶、RNase酶抑制劑購自TaKaRa公司；2×Es Taq MasterMix（Dye）購自康為世紀生物公司；Bst DNA大片段聚合酶、10×Thermopol Reaction Buffer、TⅠ和Ⅰ購自NEB，特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；SYBR Green I核酸染料購自Solarbio公司；其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank中SPFMV的CP基因序列（登錄號：FJ155666），利用LAMP引物設計軟件Primer Explorer V4設計RT-LAMP擴增引物SPFMV-F3、SPFMV-B3、SPFMV-FIP、SPFMV-BIP共4條；同時利用DNAMAN設計RT-PCR擴增引物SPFMV-F和SPFMV-R共2條，引物序列見表1。

表1 RT-LAMP和RT-PCR特異性檢測SPFMV的引物

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 稱取甘薯樣品葉片約0.1 g，液氮冷凍后迅速研磨，按TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒說明書提取葉片總RNA，保存于-80℃備用。按照HiScript?II 1st Stand cDNA Synthesis Kit說明書，以RNA為模板合成cDNA，保存于-20℃備用。

1.2.3 RT-PCR檢測 RT-PCR擴增體系：2×Es Taq MasterMix 7.5 μL，SPFMV-F/R（10 μmol·L-1）引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O補足總體積至15 μL。反應條件：預變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃1 min，循環35次，終延伸72℃10 min。陰性樣品葉片總RNA反轉錄的cDNA作為陰性對照的模板，ddH2O為空白對照模板。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 RT-LAMP反應條件優化和檢測體系的建立 RT-LAMP反應體系：SPFMV-FIP和SPFMV-BIP引物各1.2 μmol·L-1，SPFMV-F3和SPFMV-B3引物各0.2 μmol·L-1，dNTPs 0.125 mmol·L-1，Betaine 1 mol·L-1，1×Thermo Polreaction buffer，RNA酶抑制劑40 U，Bst DNA polymerase 8 U，M-MLV 200 U；RNA模板1 μL，補充ddH2O至25 μL（RNA模板為經RT-PCR檢測及測序鑒定的感染SPFMV甘薯葉片總RNA）。RT-LAMP 反應條件：65℃ 1 h，85℃5 min。健康甘薯葉片總RNA反轉錄的cDNA作為陰性對照的模板，ddH2O為空白對照模板。設置SPFMV F3/B3﹕FIP/BIP引物濃度比梯度（1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10），dNTPs濃度梯度（0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825 mmol·L-1），Betaine濃度梯度（0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1），不同的反應溫度（59、61、63、65、67和69℃）和反應時間（20、30、40、50、60、70、80和90 min）。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物。

1.2.5 RT-LAMP產物鑒定 將RT-LAMP產物經瓊脂糖電泳分離后，切取大小200 bp左右的條帶，回收純化后連接于pMD18-T載體，連接產物轉化大腸桿菌感受態DH5，PCR鑒定后送陽性克隆到進行測序。利用BLAST對測序結果與GenBank已報道序列進行比對。

用DNAMAN軟件分析RT-LAMP擴增片段序列，選用Ⅰ（GAATGCN?）和TⅠ（C?TTAAG）進行酶切鑒定，Ⅰ理論酶切片段大小為97和102 bp，TⅠ理論酶切片段大小為75和124 bp。利用苯酚和異丙醇回收純化RT-LAMP擴增產物，取1μg擴增產物分別進行TⅠ和Ⅰ單酶切，反應體系參照酶試劑盒說明書。取20 μL酶切產物用3%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.2.6 RT-LAMP特異性、靈敏度測定及熒光染料檢測RT-LAMP產物 以分別攜帶SPFMV、甘薯C病毒（C，SPVC）、SPCSV、甘薯病毒2（2，SPV2）、甘薯潛隱病毒（，SPLV）、甘薯G病毒（G，SPVG）和甘薯褪綠斑病毒（，SPCFV）的甘薯葉片總RNA為模板，利用優化好的反應體系進行RT-LAMP擴增和電泳檢測，并與RT-PCR擴增結果進行對比。

將感染SPFMV的甘薯葉片總RNA用無RNA酶的水分別進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的倍比稀釋，以稀釋后的RNA作為模板進行RT-LAMP和RT-PCR靈敏度對比試驗，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.2.7 RT-LAMP方法的應用 提取從山東省采集的疑似SPFMV甘薯植株葉片總RNA，分別用優化后的RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳分別檢測反應產物。向RT-LAMP反應產物中加入0.1 μL SYBR green I 核酸染料，直接觀察檢測結果，陽性為綠色，陰性為橙色[27-28]。

2 結果

2.1 RT-LAMP反應體系優化

為了建立最優的RT-LAMP檢測體系，對引物濃度、dNTPs濃度、Betaine濃度、反應溫度和反應時間進行優化。引物優化結果顯示，SPFMVF3/B3與FIP/BIP的濃度比例在1﹕4、1﹕6、1﹕8時能檢測到條帶，1﹕4時條帶最亮，即F3/B3和FIP/BIP的引物濃度分別為0.2和0.8 μmol·L-1（圖1-A）。對dNTPs濃度進行調整，結果顯示dNTPs濃度為0.125—0.525mmol·L-1時可檢測到條帶，其中以0.325和0.425 mmol·L-1效果最佳，本著節儉成本的原則確定dNTPs濃度為0.325mmol·L-1（圖1-B）。進一步設置不同的Betaine濃度，結果表明在0.4、0.7、1.0和1.3 mol·L-1時均能檢測到條帶，濃度為1.0 mol·L-1時，擴增效果最佳（圖1-C）。設置不同的反應溫度，在59—67℃均有條帶，65℃時條帶最為清晰（圖1-D）。最后對反應時間進行優化，反應持續40 min時可觀察到擴增條帶，70 min時擴增條帶最亮（圖1-E）。綜上，最終確定SPFMV最優的RT-LAMP檢測體系為SPFMV-FIP和SPFMV-BIP引物各0.8 μmol·L-1，SPFMV-F3和SPFMV-B3引物各0.2 μmol·L-1，dNTPs 0.325 mmol·L-1，Betaine 1 mol·L-1。RT-LAMP反應條件為65℃70 min，85℃5 min。

2.2 RT-LAMP產物鑒定

將200 bp左右的RT-LAMP擴增條帶進行測序，并與GenBank已報道序列進行比對。結果顯示，序列與SPFMV（登錄號AF015540.1）的核苷酸序列同源性為99%，說明本體系擴增序列為SPFMV的基因序列。RT-LAMP產物酶切結果顯示，Ⅰ酶切產生條帶為97和102 bp，TⅠ酶切產生的條帶為75和124 bp（圖2），與理論值相符，進一步證明該體系擴增產物為SPFMV CP基因序列。

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對照和空白對照Negative control and blank control。A：F3/B3和FIP/BIP引物濃度比The ratio of primer concentration， 3-8: 1﹕1 (0.2 μmol·L-1﹕0.2 μmol·L-1), 1﹕2 (0.2 μmol·L-1﹕0.4 μmol·L-1), 1﹕4 (0.2 μmol·L-1﹕0.8 μmol·L-1), 1﹕6 (0.2 μmol·L-1﹕1.2 μmol·L-1), 1﹕8 (0.2 μmol·L-1﹕1.6 μmol·L-1), 1﹕10 (0.2 μmol·L-1﹕2.0 μmol·L-1)；B：dNTPs濃度梯度The gradient of dNTPs concentration，3-11: 0.025, 0.125, 0.225, 0.325, 0.425, 0.525, 0.625, 0.725, 0.825 mmol·L-1；C：Betaine濃度梯度The gradient of Betaine concentration，3-7: 0.4, 0.7, 1.0, 1.3, 1.6 mol·L-1；D：溫度梯度The gradient of temperature，3-8: 59, 61, 63, 65, 67, 69℃；E：時間梯度The gradient of time，3-10：20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 min

2.3 特異性檢測

以分別含有SPVC、SPCSV、SPV2、SPLV、SPVG、SPCFV以及SPFMV病毒甘薯葉片的RNA為模板，利用普通RT-PCR和2.1優化的RT-LAMP兩種方法進行擴增。結果顯示，RT-LAMP和RT-PCR的擴增結果一致，并且只能在攜帶SPFMV的甘薯樣品中擴增出條帶，而攜帶其他病毒的甘薯樣品皆沒有擴增到條帶（圖3），表明建立的SPFMV RT-LAMP檢測體系具有很好的特異性。

2.4 RT-LAMP與RT-PCR靈敏度比較

提取感染SPFMV甘薯葉片總RNA，用紫外分光光度計測定其濃度為121.6 ng·L-1。將RNA按10倍梯度進行稀釋，分別進行RT-LAMP和RT-PCR擴增。結果顯示，RT-LAMP在RNA原液、10-1—10-4稀釋液為模板下可擴增到條帶，即本研究建立的SPFMV RT-LAMP方法檢測到目標病毒的葉片RNA濃度最低為121.6×10-4ng·μL-1（圖4-A），而RT-PCR能在RNA原液、10-1—10-3稀釋液模板中擴增到條帶，即RT-PCR方法檢測到目的病毒的葉片RNA濃度最低為121.6× 10-3ng·μL-1（圖4-B）。表明本研究建立的RT-LAMP方法較普通RT-PCR方法檢測靈敏度高10倍。

2.5 RT-LAMP技術的田間檢測應用

對采自山東的甘薯疑似病株分別進行RT-LAMP和RT-PCR檢測，結果顯示，12份樣品中（部分結果）利用RT-LAMP檢測方法檢測出7份SPFMV陽性樣品（圖5-B），與RT-PCR檢測結果一致（圖5-A）。往RT-LAMP產物中加入SYVR green I核酸熒光染料，電泳檢測有條帶的樣品迅速變為綠色，無條帶的樣品為橙色（圖5-C），與RT-LAMP和RT-PCR檢測結果一致。綜上，表明本研究建立的RT-LAMP檢測方法可用于田間甘薯樣品SPFMV檢測。

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對照和空白對照Negative control and blank control；3-9: SPFMV, SPVC, SPCSV, SPV2, SPLV, SPVG, SPCFV

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對照和空白對照Negative control and blank control，3—10：RNA濃度分別為121.6、121.6×10-1、121.6×10-2、121.6×10-3、121.6×10-4、121.6×10-5、121.6×10-6和121.6×10-7 ng·μL-1 The concentration of RNA is 121.6, 121.6×10-1, 121.6×10-2, 121.6×10-3, 121.6×10-4, 121.6×10-5, 121.6×10-6 and 121.6×10-7 ng·μL-1, respectively

3 討論

SPFMV是全球影響甘薯的最具破壞性的病毒之一，其寄主植物廣泛，對甘薯的危害尤其嚴重[1-9]。由于甘薯主要為營養繁殖，容易造成病毒的逐年積累，造成甘薯產量降低，品質變劣和種性退化，嚴重危害甘薯產業發展。近年來地域間種質資源的頻繁交流，也促使甘薯病毒病發生擴散[1-3]。因此，加強早期預警和種薯種苗的檢驗檢疫，對防止甘薯病毒病的傳播具有重要意義。目前，針對SPFMV的檢測技術已經有很多，包括常規RT-PCR、熒光定量PCR、血清學檢測等，但多有操作繁雜、耗時較長等特點[10-14]。RT-LAMP檢測技術是一種新型的檢測技術，具有快速、簡單、靈敏等特點，已廣泛應用于人類和動植物的各種病原微生物的快速診斷和檢測[16-30]。2013年，喬奇等[27]建立的SPCSV RT-LAMP檢測方法，實現了對SPCSV的快速檢測。本研究建立了針對SPFMV的RT-LAMP檢測體系，僅需70 min即可獲得檢測結果，并可通過熒光顯色劑直接觀察結果，不需要借助復雜儀器設備，節約了大量的成本和檢測時間，適合在基層檢測部門中廣泛應用。

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對照和空白對照Negative control and blank control；3—14：田間采集的甘薯樣品sweet potato samples collected in the field

多種甘薯病毒共同侵染時，一般具有協生作用[31-34]。作為中國甘薯的主要病毒，SPFMV常與其他多種病毒發生復合侵染現象，導致葉片扭曲、畸形和植株矮化等嚴重癥狀，使甘薯產量損失嚴重，對甘薯造成毀滅性危害[1,4-5]。但當SPFMV單獨侵染甘薯時，植株體內病毒含量較低，引起的癥狀輕微，難以直接進行診斷鑒定[34]。對SPFMV的發生進行早期預警，可有效減少甘薯病毒病害造成的損失。本研究建立并優化的RT-LAMP體系具有高特異性和靈敏度，針對同屬病毒侵染的樣品，也實現了準確檢測，且比常規RT-PCR檢測方法的靈敏度高10倍。筆者實驗室利用RT-LAMP對山東多地采集的145份甘薯疑似病樣進行鑒定，其中檢測到SPFMV陽性樣品83份，發病率達57.24%（完整結果未提供），對病毒含量較低的樣品也可有效檢測。表明建立的SPFMV RT-LAMP檢測方法具有快速、高效的特點，為種薯、種苗和脫毒苗的檢測和鑒定提供了有利的技術支持。

4 結論

建立了SPFMV的RT-LAMP檢測體系，實現了檢測結果的可視化，具有簡單、快速、特異和高靈敏度等優點，不需要復雜的儀器設備，適于科研機構和基層檢測部門使用。

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（責任編輯 岳梅）

Development of RT-LAMP Assay for Rapid Detection of(SPFMV)

JIANG ShanShan, FENG Jia, ZHANG Mei, WANG ShengJi, XIN ZhiMei, WU Bin, XIN XiangQi

(Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100)

【】(SPFMV) is an important virus infecting sweet potato plants. The objective of this study is to establish a rapid and efficient method for the detection of SPFMV by using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method.【】Four specific RT-LAMP primers for SPFMV detection including SPFMV-FIP (5′-TAAGCGCGGCTGCCTTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′), SPFMV-BIP (5′-TCGGTTGTTTGGT TTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′), SPFMV-F3 (5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′) and SPFMV-B3 (5′-ACCCC TCATTCCTAAGAGGT-3′) were designed by Primer Explorer V4 according to the nucleotide sequence of SPFMV coat protein (CP) gene in GenBank as well as two specific reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) primers for SPFMV detection including SPFMV-F (5′-TCTAATGAGAACACTGAATT-3′) and SPFMV-R (5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′). Different reaction conditions were optimized in the RT-LAMP in order to improve specificity and sensitivity of the detection, including the primers concentration ratios of F3/B3 to FIP/BIP (1﹕1, 1﹕2, 1﹕4, 1﹕6, 1﹕8 and 1﹕10), dNTPs concentrations (0.025, 0.125, 0.225, 0.325, 0.425, 0.525, 0.625, 0.725 and 0.825 mmol·L-1), Betaine concentrations (0.4, 0.7, 1.0, 1.3 and 1.6 mol·L-1), reaction temperatures (59, 61, 63, 65, 67 and 69℃) and reaction times (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 and 90 min). The best reaction conditions were confirmed according to the test results of agarose gel electrophoresis. The RT-LAMP products were identified by sequencing and enzyme analysis. The detection specificity of RT-LAMP was tested by using different RNA templates from SPFMV,C (SPVC),(SPCSV),2 (SPV2),(SPLV),G (SPVG),(SPCFV) and leaf sample of healthy sweet potato plant. The sensitivities of RT-LAMP and RT-PCR for detecting SPFMV were compared by using ten-fold serially diluted RNA templates of SPFMV (including original RNA, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6and 10-7dilutions). Finally, the optimized RT-LAMP and RT-PCR were used to detect the samples of SPFMV collected from Shandong Province. 【】The RT-LAMP rapid detection method of SPFMV was established and the optimal amplification was achieved by incubation of 0.8 μmol·L-1SPFMV-FIP/SPFMV-BIP, 0.2 μmol·L-1SPFMV-F3/SPFMV-B3, 0.325 mmol·L-1dNTPs, 1 mol·L-1Betaine with template RNA at 65℃ for 70 min. The specificity test showed that the RT-LAMP method established in this study could amplify the typical ladder-like bands only to the RNA carrying SPFMV. The lowest detectable RNA concentration of RT-LAMP was 121.6×10-4ng·μL-1, while the lowest detectable RNA concentration of RT-PCR was 121.6×10-3ng·μL-1, indicating that the sensitivity of RT-LAMP was 10 times higher than RT-PCR for detecting SPFMV. The optimized RT-LAMP method was applied to the detection of SPFMV in field samples and the results were consistent with the visual inspection of RT-LAMV products. It suggested that the RT-LAMP detection method could be applied to detect the SPFMV in the field.【】The RT-LAMP established in this study has high sensitivity and speci?city, and is suitable for rapid detection of SPFMV in the field.

sweet potato;(SPFMV); RT-LAMP; detection

2017-09-29；

2017-12-12

山東省重點研發計劃（2016GNC111003）、國家公益性行業（農業）科研專項（201303028）、山東省農業科學院農業科技創新工程（CXGC2016B11）

姜珊珊，E-mail：shanshan2113@163.com。

辛相啟，E-mail：xinxiangqi@126.com