大豆抗豆卷葉螟的轉錄組和蛋白質組關聯分析

曾維英，孫祖東，賴振光，蔡昭艷，陳懷珠，楊守臻，唐向民

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大豆抗豆卷葉螟的轉錄組和蛋白質組關聯分析

曾維英，孫祖東，賴振光，蔡昭艷，陳懷珠，楊守臻，唐向民

（廣西農業科學院經濟作物研究所/農業部西南玉米大豆間套作區農業科學觀測實驗站，南寧 530007）

【】通過對大豆受豆卷葉螟幼蟲脅迫下的轉錄組和蛋白質組結果進行聯合分析，篩選出一些與大豆抗豆卷葉螟相關的候選基因，為深入認識大豆抗豆卷葉螟的分子調控機制奠定基礎。【】以高抗材料趕泰-2-2（HR）和高感材料皖82-178（HS）為研究對象，運用RNA-Seq技術和iTRAQ技術鑒定出豆卷葉螟幼蟲取食誘導0和48 h時樣品間的差異表達基因（DEGs）和差異表達蛋白（DEPs），將在蛋白水平和轉錄水平關聯到的所有可定量數據進行關聯分析，計算蛋白水平和轉錄水平間的相關系數。【】蛋白質鑒定結果表明，HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中分別鑒定出236、250、213、211個DEPs；轉錄組鑒定結果表明，HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中分別鑒定出1 064、680、605、468個DEGs。定量關聯分析結果表明，HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組的相關系數分別為0.156、0.2687、0.1149和0.035；HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中分別關聯到11、9、3和4個DEPs/DEGs，其中蛋白和mRNA表達趨勢相同的基因分別有11、9、2和3個，蛋白和mRNA表達趨勢相反的基因分別有0、0、1和1個。生物信息學分析結果表明，這些差異蛋白功能涉及代謝途徑、核糖體、類黃酮生物合成、亞油酸代謝、氨基糖-核苷酸代謝、氨酰生物合成、亞麻酸代謝、次生代謝產物的生物合成、苯基丙酸生物合成、RNA運轉、谷胱甘肽代謝、抗壞血酸鹽和aldarate代謝等。功能關聯分析結果表明，HR48/HR0比較組中有27條Pathway通路共關聯到101個DEPs和23個DEGs，HS48/HS0比較組中有15條Pathway通路共關聯到147個DEPs和16個DEGs，HR0/HS0比較組中有18條Pathway通路共關聯到82個DEPs和10個DEGs，HR48/HS48比較組中僅有1條Pathway通路關聯到71個DEPs和2個DEGs。同時關聯發現胰蛋白酶抑制劑A、K型胰蛋白酶抑制劑、查爾酮異構酶4、脂氧合酶9、α-加氧合酶1、9S-脂氧合酶、植物凝集素前體、POD12、應激蛋白SAM22和cAPX1等可能是大豆抗豆卷葉螟潛在的靶標蛋白（基因）。qRT-PCR表達分析結果表明，5個DEPs/DEGs在HR48/HR0比較組的表達趨勢與它們的RNA-Seq和iTRAQ結果基本一致。【】確定了一些與豆卷葉螟的抗性相關蛋白（基因）和代謝通路，這些差異蛋白可能直接或間接參與大豆對豆卷葉螟的抗蟲反應。

大豆；豆卷葉螟；轉錄組；蛋白質組；關聯分析

0 引言

【研究意義】大豆是世界主要的油料作物，廣泛應用于食品、飼料、工業生產以及其他產業領域[1]。然而，蟲害大大増加了大豆生產的成本。豆卷葉螟屬鱗翅目螟蛾科，以幼蟲卷曲大豆葉片并潛伏其中取食大豆葉片組織，影響光合作用，使植株不能正常生長，是重要的大豆食葉性害蟲[2]。在吉林省、遼寧省以南、四川省以東地區均有發生，在南方大豆產區一年可發生多代，在發生危害嚴重的年份，葉片被取食后只剩葉脈和葉柄，造成產量的嚴重損失[3]。因此，挖掘出大豆抗豆卷葉螟相關的功能基因，對開展大豆抗豆卷葉螟分子育種具有重要意義。【前人研究進展】孫祖東等[4]研究表明卷包密度和蟲口密度可作為鑒定大豆種質抗豆卷葉螟的鑒定指標，并且篩選出高抗品種趕泰-2-2、牛黃豆、PI227687等，高感品種皖82-178、金龍黑豆、Mosoy等。邢光南等[5]研究表明豆卷葉螟引起的蟲包數和卷葉率與葉片、葉柄茸毛角度及葉片茸毛長度極顯著正相關，而與葉片茸毛密度顯著負相關，與茸毛末端形態無關。葉片茸毛角度與抗蟲性指標相關性最強，是大豆抗豆卷葉螟的重要因子。邢光南等[6]、李廣軍等[7]研究表明大豆對豆卷葉螟抗性符合2對主基因+多基因的混合遺傳模式。李廣軍等[8]對豆卷葉螟抗性進行QTL定位，檢測到位于D1b和K連鎖群上有2個QTL、位于A2、D1b、K和N連鎖群上有4個QTL和6個互作QTL。XING等[9]研究表明大豆抗豆卷葉螟的4個RIL群體中KY群體檢測到8個QTL、WT群體檢測到10個QTL、XG和SX群體各檢測到1個加性QTL，其中和是主效QTL。【本研究切入點】因蛋白質組與轉錄組分別從2個不同層面反映了基因的表達情況，所以要了解轉錄組與蛋白質組的相互調控作用，需要對mRNA與蛋白質的表達進行同步監測。關聯分析的目的之一是實現數據互補，得到生物體更加完整的表達信息。關于大豆抗豆卷葉螟的轉錄組和蛋白質組關聯分析未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以大豆高抗豆卷葉螟材料（趕泰-2-2）和高感豆卷葉螟材料（皖82-178）為研究對象，以iTRAQ分析的蛋白質組結果為基礎，與RNA-Seq測序獲得的轉錄組結果進行定量和功能關聯分析，以期篩選出一些可能作為大豆抗豆卷葉螟的潛在靶標蛋白（基因），為大豆抗豆卷葉螟的分子調控機制深入研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大豆品種為趕泰-2-2（高抗材料）和皖82-178（高感材料）。試驗材料于2015年7月種植在廣西農業科學院試驗田防蟲網室中，3行區播種，每行10株，在大豆整個生育期間不噴施農藥和肥料。待植株長至10片復葉時，按照豆卷葉螟4齡幼蟲每苗接5蟲的密度分別接蟲。接蟲0 h（未接蟲，對照）和48 h后對樣品進行取樣，每個處理2個生物學重復。分別命名為HR0、HR48（抗性基因型）和HS0、HS48（感性基因型），其中數字0和48代表處理時間。每個樣品取5株混合，用液氮迅速冷凍并儲存在-80℃冰箱備用。

1.2 蛋白質組學研究方法

采用丙酮沉淀法提取葉片蛋白質[10]。蛋白質濃度通過Bradford測定法以牛血清蛋白（BSA）系列濃度為標準來測定[11]，利用SDS-PAGE檢測蛋白質量和濃度。獲得的蛋白樣本保存在-80℃冰箱中備用。iTRAQ試驗及其結果分析由深圳華大基因研究院完成。趕泰-2-2在豆卷葉螟取食前的酶標是113和115標記、取食48 h的酶標是117和119標記，皖82-178在豆卷葉螟取食前的酶標是114和116標記、取食48 h的酶標是118和121標記。將標記后的各組肽段混合，真空抽干后用SCX柱進行液相分離，再進行基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析。對質譜下機的原始文件進行峰識別以獲取峰列表，建立參考數據庫，進行肽段及蛋白質的鑒定。利用Proteome Discoverer 2.2軟件將從Orbitrap獲得的質譜原始文件轉換成MGF文件格式并進行搜索數據庫。使用Mascot搜索引擎將原始數據比對到NCBI中包含65，681個序列的大豆數據庫（http://www.ncbi.nih.gov/genomes/Glycine_ max/protein）進行搜庫鑒定蛋白質。為了降低假陽性多肽識別概率，通過Mascot概率分析時僅鑒定具有95%置信度的多肽。每個確定的識別蛋白至少具有1個Unique peptide。對于蛋白質的定量，必須至少包含2個Unique peptide。蛋白定量比例通過Mascot的中位比例進行加權和標準化，本研究中以“|Fold Change|≥1.2和≤0.05”作為閾值來判斷蛋白豐度差異的顯著性。

1.3 轉錄組學研究方法

利用TRIzol Kit（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分別提取高抗材料與高感材料葉片的總RNA（5 μg）。利用超微量分光光度計NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）檢測總RNA的濃度與純度，利用生物學分析儀Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，Santa Clara，CA，USA）檢測RNA的完整性。利用TruseqTMRNA樣本制備試劑盒（Illumina，SanDiego，CA，USA）進行mRNA純化和cDNA文庫構建，對獲得的cDNA文庫進行PCR擴增富集，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。利用微型熒光計TBS380（QuantiFluoTMST/P，Promega，Madison，WI，USA）對cDNA文庫進行定量。最后，使用Illumina HiseqTM2000測序儀進行測序（Hiseq2000 Truseq SBS Kit v3-HS(200cycles)，Illumina）。以上試驗均由深圳華大基因科技服務有限公司完成。經Base calling轉化為Raw data或Raw reads，隨后對Raw reads進行質控（QC）[12]。利用SOAPfuse軟件[13]對原始測序數據進行去除處理得到Clean reads。利用Tophat將Clean reads比對到大豆參考基因組ftp://ftp.jgi-psf.org/ pub/compgen/phytozome/v9.0/early_release/ Gmax_275 _Wm82.a2.v1/, version Glyma2.0），允許有2個堿基的錯配[14-15]。表達定量的結果以FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）為單位，在得到差異檢驗的FDR值同時，根據基因的表達量（FPKM值）計算該基因在不同樣本間的差異表達倍數。以“FDR≤0.001和|log2Ratio（FC，Fold Change）|≥2”作為閾值來判斷基因差異表達的顯著性[16]。

1.4 生物信息學分析

利用Blast2go_v2.5軟件對被鑒定的差異基因/蛋白進行GO注釋分析，計算得到的-value通過Bonferroni校正之后，以Corrected-value≤0.05為閾值。利用Blast_v2.2.26軟件在KEGG pathway數據庫對所鑒定到的差異基因/蛋白進行Pathway富集分析，計算得到的-value通過Bonferroni校正之后，以Corrected-value≤0.05為閾值。

1.5 關聯分析

將在蛋白水平和轉錄水平關聯到的所有可定量數據進行關聯分析。基于蛋白質組鑒定結果，篩選出符合條件的可定量蛋白質，篩選條件為：該蛋白可定量Unique peptide≥2時，計算Peptide ratio，以Peptide ratio的中值代表該蛋白的Ratio，然后與轉錄組測序結果中基因的Ratio比值進行關聯分析，計算蛋白水平和轉錄水平間Person相關系數[17]，確定蛋白和mRNA的相關性的強弱。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

選取了5個與抗豆卷葉螟相關潛在功能基因進行qRT-PCR驗證。參考unigene序列，引物序列用軟件Primer Premier 5.0（premier biosoft international，palo alto，CA）設計。用帶有gDNA消除劑的PrimeScript?RT試劑盒安裝廠家說明書對經過DNA酶純化的RNA樣本反轉錄合成cDNA。qRT-PCR反應混合液（25 μl）包含SybrGreen qPCR Master Mix 12.5 μl、正反引物（10 μmol·L-1）各0.5 μl、cDNA模板2 μl和ddH2O 9.5 μl。qRT-PCR反應程序為95℃2 min；95℃ 10 s，60℃ 40 s，共40個循環。qRT-PCR分析由ABI7500FAST型實時-熒光定量PCR儀完成。以作為內參基因，利用2-ΔΔct法計算基因的相對表達量。

2 結果

2.1 蛋白質組和轉錄組數據分析

2.1.1 蛋白質組數據分析 利用iTRAQ技術分析抗感材料受豆卷葉螟取食前后葉片的蛋白質差異，結果共產生354 049張圖譜。利用Mascot軟件分析發現共45 454張譜圖匹配到大豆參考基因組的已知譜圖上，其中28 525張匹配到Unique圖譜。鑒定到15 264個肽段，11 068個Unique肽段，最終鑒定出4 073個蛋白質。

當蛋白質豐度比達到1.2倍以上，且經統計檢驗其-value≤0.05時，認為此蛋白為兩樣品間的差異表達蛋白（DEPs）。結果表明，HR48/HR0比較組中鑒定出236個DEPs，其中120個上調表達，116個下調表達；HS48/HS0比較組中鑒定出250個DEPs，其中140個上調表達，110個下調表達；HR0/HS0比較組中鑒定出213個DEPs，其中109個上調表達，104個下調表達；HR48/HS48比較組中鑒定出211個DEPs，其中125個上調表達，86個下調表達。

2.1.2 轉錄組數據分析 利用Illumina HiseqTM2000測序儀對抗感材料受豆卷葉螟取食誘導前后葉片轉錄組進行高通量測序。結果表明，8個測序樣品共產生458 758 338條100 bp的Raw reads，經過去除低質量Reads，共剩余442 422 398條100 bp的高質量Clean reads。通過Tophat軟件將獲得的所有Clean reads比對到大豆參考基因中，匹配比例范圍為84.81%—87.67%。

當FDR≤0.001，且|log2Ratio（FC，Fold Change）|≥2時，認為此基因是兩樣品間的差異表達基因（DEGs）。結果表明，HR48/HR0比較組中鑒定出1 064個DEGs，其中894個上調表達，170個下調表達；HS48/HS0比較組中鑒定出680個DEGs，其中495個上調表達，185個下調表達；HR0/HS0比較組中鑒定出605個DEGs，其中192個上調表達，413個下調表達；HR48/HS48比較組中鑒定出468個DEGs，其中202個上調表達，266個下調表達。

2.2 定量關聯性分析

2.2.1 轉錄組和蛋白質組數量關聯關系 首先，對趕泰-2-2與皖82-178在豆卷葉螟取食前后獲得的轉錄組測序結果被用于CDS（coding sequence）預測，從而獲得這些基因的蛋白質序列。然后，將獲得的蛋白質序列作為搜索數據庫。為了避免假陽性的出現，轉錄組和蛋白質組結果再次進行統一參考基因組數據庫（大豆參考基因組）搜索比對。當某一蛋白被鑒定并且在轉錄組水平有表達量信息時，被認為關聯。

在鑒定、定量和顯著差異3個范圍中，能關聯的蛋白質和基因數量見表1。HR48/HR0比較組中有3 973個基因在蛋白質和mRNA水平均被鑒定，并定量2 128個基因，有11個DEPs同DEGs關聯；HS48/HS0比較組中有3 976個基因在蛋白質和mRNA水平均被鑒定，并定量2 127個基因，有9個DEPs同DEGs關聯；HR0/HS0比較組中有3 977個基因在蛋白質和mRNA水平均被鑒定，并定量2 124個基因，有3個DEPs同DEGs關聯；HR48/HS48比較組中有3 973個基因在蛋白質和mRNA水平均被鑒定，并定量2 132個基因，有4個DEPs同DEGs關聯。

2.2.2 轉錄組和蛋白質相關性分析 對4個比較組中鑒定出的蛋白質水平和mRNA水平的相對表達量進行關聯分析，且將蛋白和mRNA表達量的變化分為4種類型：蛋白和mRNA表達趨勢相同、蛋白和mRNA表達趨勢相反、蛋白表達有差異而mRNA表達無差異和蛋白表達無差異而mRNA表達有差異。結果表明，HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組的相關系數分別為0.1565、0.2687、0.1149和0.035（圖1）。HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中關聯到蛋白和mRNA表達趨勢相同的基因分別有11、9、2和3個，說明在轉錄后或翻譯水平蛋白不受調控或調控較少的基因；蛋白和mRNA表達趨勢相反的基因分別為0、0、1和1個；蛋白表達有差異而mRNA表達無差異的基因分別有225、241、210和207個，可能樣本間的蛋白翻譯修飾有差異；蛋白表達無差異而mRNA表達有差異的基因分別有35、26、10和8個，可能mRNA受到轉錄后調控（表2）。

表1 在鑒定、定量、顯著差異3個范圍中，能被關聯的蛋白質和基因數量關系

通過關聯分析，發現一些可能與大豆抗豆卷葉螟脅迫相關的靶標蛋白（表3），如胰蛋白酶抑制劑A、查爾酮異構酶4、醌氧化還原酶蛋白質At1g23740、莖31 kD糖蛋白前體、橡膠蛋白、脂氧合酶9、α-加氧合酶1、植物凝集素前體、POD12、莖28 kD糖蛋白前體和應激蛋白SAM22等受豆卷葉螟脅迫后受均上調表達，可能在應答豆卷葉螟脅迫中扮演重要角色。而cAPX1在豆卷葉螟取食前后，在高抗材料中的表達量始終高于高感材料，可能是貯存在植物體內的抑制昆蟲聚集的種間感應的化合物，是一個組成型防御蛋白。這些DEPs與DEGs的表達豐度不一致，如蛋白表達豐度較mRNA低或高，可能是在轉錄后或翻譯水平調控，miRNA調控靶基因導致抑制蛋白翻譯或積累蛋白。

A：HR48-VS-HR0；B：HS48-VS-HS0；C：HS0-VS-HR0；D：HS48-VS-HR48

表2 4種蛋白和mRNA表達量變化類型

表3 基因和蛋白質水平上鑒定出的表達模式相同或相反的共有DEPs/DEGs

2.2.3 表達趨勢相同的DEPs/DEGs生物信息學分析 對關聯到的蛋白和mRNA表達趨勢相同的DEPs/ DEGs進行GO功能顯著性富集分析，以確定差異表達基因行使的主要功能。結果表明，HR48/HR0比較組中關聯到的11個DEPs/DEGs生物學過程有代謝過程、刺激響應、細胞過程、多生物過程和免疫系統過程，參與細胞組分主要有細胞部分和細胞，分子功能主要有結合、催化活性、庫營養活動、酶調節活性；HS48/HS0比較組中關聯到的9個DEPs/DEGs生物學過程有代謝過程、刺激響應、細胞過程，參與細胞組分有細胞部分、細胞、細胞器和膜，分子功能主要有結合、催化活性、庫營養活動、酶調節活性和抗氧化活性；HR0/HS0比較組中關聯到的2個DEPs/DEGs生物學過程有代謝過程、細胞過程和刺激響應過程，參與細胞組分有細胞部分和細胞，分子功能主要有結合、催化活性、抗氧化活性；HR48/HS48比較組中關聯到的3個DEPs/DEGs生物學過程有代謝過程、細胞過程和刺激響應過程，參與細胞組分有細胞部分、細胞、細胞器、細胞器部分、復雜大分子，分子功能主要有結合、催化活性、結構分子活性和抗氧化活性。當大豆受到豆卷葉螟危害以后，植物體內的防御系統會立即響應刺激，適當地增加體內的代謝活動，產生防御物質，而且增強各種酶的活性來促進防御。

利用KEGG pathway數據庫對共有DEPs/DEGs進行了Pathway富集分析，確定蛋白質參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。結果表明，HR48/HR0比較組中關聯到的11個DEPs/DEGs中有9個Pathway到8條代謝通路中，為代謝途徑、核糖體、類黃酮生物合成、亞油酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、氨酰生物合成、亞麻酸代謝、次生代謝產物的生物合成；HS48/HS0比較組關聯到的9個DEPs/DEGs中有7個Pathway到6條代謝通路中，為代謝途徑、亞油酸代謝、核糖體、苯基丙酸生物合成、RNA運轉、次生代謝產物的生物合成。HR0/HS0比較組中關聯到的2個DEPs/DEGs Pathway到3條代謝通路中，為亞油酸代謝、抗壞血酸鹽和aldarate代謝、谷胱甘肽代謝；HR48/HS48比較組中關聯到的3個DEPs/DEGs Pathway到3條代謝通路中，為谷胱甘肽代謝、核糖體、抗壞血酸鹽和aldarate代謝。

2.3 功能方面關聯分析

有些DEPs和DEGs雖然在定量上沒有被關聯，但它們可能同時參與某條Pathway通路，從而使該條通路發生變化。因此利用KEGG數據庫對轉錄組和蛋白組數據同時進行Pathway注釋，把這些DEPs和DEGs進行功能關聯，將轉錄組和蛋白組表達數據在一張通路圖中展示，直觀展示一條通路中的所有轉錄組和蛋白質組鑒定和定量到的數據，從生物學代謝通路的角度進一步說明蛋白組和轉錄組富集關聯情況。

功能方面關聯到的代謝通路中涉及到的差異蛋白直接或間接參與大豆對豆卷葉螟的抗蟲反應，在同一代謝途徑中顯示出mRNA上調表達，蛋白上調表達，mRNA和蛋白同時改變或者一方改變，mRNA和蛋白同時不變等情況。結果表明，HR48/HR0比較組有27條Pathway通路共關聯到101個DEPs和23個DEGs，如：代謝途徑中關聯到64個DEPs和13個DEGs、次生代謝產物的生物合成中關聯到44個DEPs和14個DEGs、核糖體中關聯到23個DEPs和1個DEGs、淀粉和蔗糖代謝中關聯到7個DEPs和1個DEGs、糖酵解/糖異生中關聯到6個DEPs和1個DEG、苯基丙酸生物合成中關聯到6個DEPs和7個DEGs等（表4），且這些DEPs和DEGs均上調表達。如在糖酵解/糖異生代謝途徑中gi|356496743|ref|XP_003517225.1|、gi|356515641|ref|XP_003526507.1|、gi|356572486|ref| XP_003554399.1|、gi|356576165|ref|XP_003556204.1||、gi|363808320|ref|NP_001241992.1|、gi|356516690|ref| XP_003527026.1|上調表達（差異表達蛋白）和gi|356497822|ref|XP_003517756.1|上調表達（差異表達基因）能調控醋酸、乙醛等物質的合成；在甘油酯代謝途徑中gi|356516690|ref|XP_003527026.1|上調表達（蛋白）和gi|356497822|ref|XP_003517756.1|上調表達（基因）都能調控D-甘油酸酯、D-甘油醛等物質的合成；在苯丙素生物合成途徑中gi|351727703|ref| NP_001236658.1|、gi|356525622|ref|XP_003531423.1|、gi|356534700|ref| XP_003535890.1|、gi|356539666|ref| XP_003538316.1|、gi|358248528|ref|NP_001240152.1|、gi|359807592|ref| NP_001240903.1|上調表達（差異表達蛋白）和gi|351726279|ref|NP_001237377.1|、gi|356498192|ref| XP_003517937.1|、gi|356568192|ref| XP_003552297.1|、gi|356568196|ref|XP_003552299.1|、gi|356576075|ref| XP_003556160.1|、gi|363807568|ref| NP_001241894.1、gi|571514246|ref|XP_006597070.1|上調表達（差異表達基因）都能調控P-羥基苯基木質素、5-羥基苯基木質素、愈創木基木質素、紫丁香木質素等物質的合成；在丙酮酸代謝途徑中gi|356495891|ref|XP_003516804.1|、gi|356516690|ref| XP_003527026.1|、gi|356555674|ref|XP_003546155.1|、gi|356569869|ref|XP_003553117.1|、gi|356576165|ref| XP_003556204.1|上調表達（差異表達蛋白）和gi|356497822|ref|XP_003517756.1|上調表達（差異基因）都能調控醋酸的合成（圖2）。HS48/HS0比較組有15條Pathway通路共關聯147個DEPs和16個DEGs，如：代謝途徑中關聯94個DEPs和9個DEGs、次生代謝產物的生物合成中關聯59個DEPs和8個DEGs、核糖體中關聯22個DEPs和1個DEGs等（表5），且這些DEPs和DEGs均上調表達。HR0/HS0比較組有18條Pathway通路共關聯82個DEPs和10個DEGs，如：代謝途徑中關聯65個DEPs和4個DEGs、次生代謝產物的生物合成中關聯44個DEPs和3個DEG、苯基丙酸生物合成中關聯6個DEPs和1個DEGs等（表6）；HR48/HS48比較組僅代謝途徑中關聯到71個DEPs和2個DEGs（表7）。

表4 HR48/HR0比較組差異表達蛋白與差異表達基因的功能關聯分析

紅色框表示蛋白表達有差異而mRNA表達無差異，藍色框表示蛋白表達無差異而mRNA表達有差異

Red box showed protein_expression_mRNA_0, blue box showed protein _0_mRNA_expression

圖2 HR48/HR0中僅蛋白表達有差異與僅mRNA表達有差異的基因的功能關聯圖

Fig. 2 Association with the function of the protein_expression_mRNA_0 or protein _0_mRNA_expression in the HR48/HR0

2.4 qRT-PCR驗證

為了驗證轉錄組和蛋白質組關聯分析結果的可信度，對HR48/HR0中5個具有相同表達模式的DEGs/DEPs進行了qRT-PCR表達分析。發現5個DEGs/DEPs的qRT-PCR表達模式與其RNA-Seq和iTRAQ結果一致（圖3）。

表5 HS48/HS0比較組中差異表達蛋白與差異表達基因的功能關聯分析

圖3 實時熒光定量PCR分析

表6 HR0/HS0比較組中差異表達蛋白與差異表達基因的功能關聯分析

表7 HR48/HS48比較組中差異表達蛋白與差異表達基因的功能關聯分析

3 討論

受到蛋白質組學技術的局限性，大多數研究主要集中在轉錄組水平，并認為蛋白質表達的多 少在很大程度上依賴于其對應的mRNA水平。由于蛋白質組和轉錄組關聯分析可以深入了解蛋白質和基因的內在聯系，能揭示基因表達的轉錄后調控狀態，因此，蛋白質組和轉錄組間的關系研究可能是未來的系統生物研究中不可忽略的一部分[18]。Wu等[19]對開花后的晚熟型甜橙突變種和其野生種果肉的轉錄組和蛋白質組進行關聯分析，與轉錄組關聯上的差異蛋白數為54個，且其中許多為柑橘成熟調控網絡相關的差異基因和蛋白。陳全助[20]對接菌后桉樹葉片的轉錄組和蛋白質組進行關聯分析，研究發現接菌誘導12 h比較組中蛋白組與轉錄組的相關系數=0.2935，而24 h的相關系數=0.6985，且多數關聯差異蛋白參與了植物的抗逆響應，如幾丁質酶、苯丙氨酸解氨酶、病程相關蛋白和過氧化物酶等。蘇亞春[21]對甘蔗崖城05-179和“ROC”22黑穗病菌接種48 h后蔗芽的轉錄組和蛋白質組進行關聯分析，研究發現崖城05-179比較組中蛋白組與轉錄組的相關系數=0.1502，“ROC”22的相關系數=0.2466。本研究通過對高抗品種趕泰-2-2和高感品種皖82-178受豆卷葉螟取食脅迫48 h時的葉片蛋白質組和轉錄組進行關聯分析。關聯分析結果顯示，HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中蛋白質組與轉錄組的相關系數分別為0.1565、0.2687、0.1149和0.035。可見4個比較組的相關性并不是很高，因DNA轉錄成mRNA以及mRNA翻譯成蛋白質的各個步驟會受到各種因子對轉錄、翻譯過程的調節及翻譯后調控[22]，使mRNA轉錄子的數目、蛋白質位置、數量和功能發生改變，從而導致mRNA與相對應蛋白質之間相關性的丟失[23]，且植株中多數基因和蛋白非差異表達。且本研究中各比較組鑒定出的DEPs較多，其中HR48/HR0比較組鑒定出236個DEPs，HS48/HS0比較組鑒定出250個DEPs，HR0/HS0比較組鑒定出213個DEPs，HR48/HS48比較組鑒定出211個DEPs，不易篩選出與抗豆卷葉螟相關的目標蛋白。通過轉錄組與蛋白質組關聯分析的手段，比較容易找出與與豆卷葉螟的抗性相關基因和蛋白及抗蟲相關代謝通路。如定量關聯分析表明，HR48/HR0和HS48/HS0比較組中篩選出的與轉錄組關聯的差異蛋白分別為11個和9個，且表達趨勢相同均為上調表達，關聯到差異蛋白主要與植物抗逆性密切相關，如胰蛋白酶抑制劑A、植物凝集素、橡膠蛋白、脂氧合酶、過氧化物酶12、α-加雙氧酶1、病程相關蛋白PR-5b、應激蛋白SAM22、查爾酮異構酶4等，可能在應答豆卷葉螟脅迫中扮演重要角色。HR0/HS0和HR48/HS48比較組中與轉錄組關聯的差異蛋白分別為3個和4個，其中與差異基因表達趨勢相同的差異蛋白數量分別為2個和3個，其中與植物抗逆相關的抗壞血酸鹽過氧化物酶1（cAPX1）上調表達，即豆卷葉螟取食前后其在趕泰-2-2中的含量始終高于皖82-178，可能是貯存在植物體內的抑制昆蟲聚集的種間感應的化合物，是一種組成型防御蛋白。功能方面關聯分析表明，HR48/HR0比較組有27條Pathway通路共關聯到101個DEPs和23個DEGs，包括代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、核糖體、苯基丙酸生物合成等；HS48/HS0比較組有15條Pathway通路共關聯到147個DEPs和16個DEGs，包括代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、核糖體等；HR0/HS0比較組有18條Pathway通路共關聯到82個DEPs和10個DEGs，包括代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、苯基丙酸生物合成等；HR48/HS48比較組僅有代謝途徑關聯到71個DEPs和2個DEGs。且所有DEPs和DEGs均上調表達，在同一代謝通路共同協調或相互協調作用調控與抗蟲相關的基因合成，功能方面關聯的代謝通路中涉及到的差異蛋白直接或間接參與大豆對豆卷葉螟的抗蟲反應。

大豆胰蛋白酶抑制劑能顯著抑制昆蟲腸中蛋白酶活性，阻礙昆蟲消化蛋白質，尤其對鱗翅目昆蟲有較強的抑制作用[24-26]。赤擬谷盜[27]、甜菜夜蛾[28]、美洲棉鈴蟲[29]、四紋豆象[29]和蜜蜂[30]等昆蟲喂養胰蛋白酶抑制劑后出現營養不良甚至死亡率升高的現象。植物凝集素是至少具有一個可與單糖或寡聚糖特異可逆結合的非催化結構域的蛋白，當凝集素隨食物進入昆蟲腸道中誘發局部或系統性毒害效應后，可能引起昆蟲的拒食、生長停滯甚至死亡[31]。已有研究表明煙草夜蛾幼蟲[32]、桃蚜[33]、番茄夜蛾[34]等昆蟲取食轉凝集素基因的植物后，其生存率、繁殖率等都大大降低。豆卷葉螟取食誘導后，胰蛋白酶抑制劑A在抗感材料中均上調表達，凝集素前體在皖82-178中上調表達。推測豆卷葉螟侵害大豆后，胰蛋白酶抑制劑A、K型胰蛋白酶抑制劑和凝集素前體從大豆受害細胞中釋放出來，影響昆蟲營養物質的正常吸收，使昆蟲生長發育受到抑制甚至死亡，從而達到殺蟲防御蟲害的目的。

茉莉酸（Jasmonic acid，JA）信號途徑在植物抗蟲反應中起重要作用，參與機械損傷和抗蟲防御信號轉導，調控著植物下游防御反應基因的表達，顯著誘導植物體內防御系統響應，減少蟲害，是病蟲害和機械傷害誘導的主要途徑[35-38]。脂氧合酶（LOX）是JA合成過程中的關鍵酶類[39]，且是植物誘導防御途徑中的重要信號因子[40]。-加雙氧酶（-DOX）也能夠催化脂肪酸氧化，其產物2-氫過氧化脂肪酸是一種新型的氧化脂肪酸，也是JA途徑中的一個酶[41]。豆卷葉螟取食誘導后，脂氧合酶-9在趕泰-2-2中上調表達，9S-脂氧合酶和α-加雙氧酶在皖82-178中上調表達。說明豆卷葉螟誘導激活了大豆JA信號途徑，JA信號途徑在不同基因型大豆抗蟲防御過程中均起重要作用。

過氧化物酶（Peroxidase，POD）是植物體內重要的防御酶系，能催化H2O2的分解來清除細胞受脅迫時產生的ROS[42-43]。POD在小麥[44-45]、高粱[46]、黃瓜[47]和水稻[41, 48]等作物中均能被昆蟲誘導。豆卷葉螟誘導后，氧化物酶-12在皖82-178中上調表達，推測該基因在高感材料中上調表達有助于降低由蟲害引起的ROS對大豆造成的傷害，維持大豆正常代謝功能。

存在于植物葉綠體和細胞質中的抗壞血酸鹽過氧化物酶（APX）是H2O2解毒體系中的關鍵酶，它通過催化抗壞血酸-谷胱甘肽循環來發揮這一關鍵作用[49-50]。高等植物的APX同工酶主要分為胞質APX（cAPX）和葉綠體APX（chlAPX），其中cAPX是植物應答惡劣環境的主要酶類[51]。CALDWELL等[52]研究表明大豆中cAPX的轉錄、翻譯和翻譯后調控能增強其抵抗環境脅迫的能力。Yoshimura等[53]研究表明缺少cAPX1會導致葉綠體H2O2清除系統的崩潰。豆卷葉螟取食前后，cAPX1在趕泰-2-2中表達量始終高于皖82-178，說明cAPX1的表達能保護重要的細胞區域免受氧化脅迫，嚴格控制細胞內H2O2水平，從而抵制蟲害入侵。

查爾酮異構酶是黃酮類化合物生物合成過程中的關鍵酶，查爾酮在查爾酮異構酶作用下形成類黃酮，是合成黃烷酮、黃酮、黃酮醇及花色素苷等物質所必需的酶，涉及了苯丙氨酸代謝途徑中各種具有防御性產物的生物合成，在植物的抗脅迫逆境脅迫方面也起著重要的作用[54-55]。豆卷葉螟誘導后，查爾酮異構酶4在趕泰-2-2中上調表達，推測其在高抗材料中能應答豆卷葉螟的防御反應。

PR-5蛋白是PRs蛋白家族中的一類，在抵抗逆境脅迫中起著非常重要的作用[56]。機械損傷或外施SA、甲基紫精、真菌誘導物、過氧化氫、磷酸鈉均能誘導大豆的應激蛋白SAM22表達[57]。豆卷葉螟誘導后，PR-5蛋白和應激蛋白SAM22在皖82-178中上調表達，推測其可能參與了高感材料的防御反應。

4 結論

HR48/HR0和HS48/HS0比較組中分別鑒定出11個和9個DEPs/DEGs且表達模式相同，HR0/HS0和HR48/HS48比較組中分別鑒定出3個和4個DEPs/ DEGs，表達模式相同的分別有2個和3個。這些差異蛋白與代謝途徑、核糖體、類黃酮生物合成、亞油酸代謝、氨基糖-核苷酸代謝、氨酰生物合成、亞麻酸代謝、次生代謝產物的生物合成、苯基丙酸生物合成、RNA運轉、谷胱甘肽代謝、抗壞血酸鹽和aldarate代謝等相關。同時，胰蛋白酶抑制劑A、K型胰蛋白酶抑制劑、查爾酮異構酶4、脂氧合酶9、α-加氧合酶1、植物凝集素前體、POD12、應激蛋白SAM22和cAPX1等可能是大豆抗豆卷葉螟潛在的靶標蛋白。

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（責任編輯 李莉）

Correlation Analysis on Transcriptomic and Proteome of Soybean Resistance to Bean pyralid()

ZENG WeiYing, SUN ZuDong, LAI ZhenGuang, CAI ZhaoYan, CHEN HuaiZhu, YANG ShouZhen, TANG XiangMin

(Institute of Economic Crops of Guangxi Academy of Agricultural Sciences/MOA Southwest Experimental Station of Maize-Soybean Intercrop, Nanning 530007)

【】In order to lay a solid basis for a holistic understanding of the defense molecular mechanism of soybean resistance toin soybean, the correlation analysis of the transcriptomic and proteomic of soybean leaves (the highly resistant line (Gantai-2-2) and the highly susceptible line (Wan 82-178)) underlarva feeding for 0 h and 48 h was conducted. 【】In this study, soybeans with high resistance and susceptibility towere selected as the research objects. The gene and protein expression abundance was analyzed for the soybean following thefeedings using RNA-Seq and iTRAQ technology, respectively. Then the correlation value between the protein level and the transcription level was calculated.【】There were 236 DEPs and 1 064 DEGs, 250 DEPs and 680 DEGs, 213 DEPs and 605 DEGs, 211 DEPs and 468 DEGs identified in HR48/HR0, HS48/HS0, HR0/HS0 and HR48/HS48. The results indicated that the correlations between the quantitative protein and mRNA were 0.156, 0.2687, 0.1149, and 0.035 in HR48/HR0, HS48/HS0, HR0/HS0 and HR48/HS48, and 11, 9, 3 and 4 DEPs/DEGs were identified, of which 11, 9, 2 and 3 with same expression trend, respectively. These differential expression proteins were revealed to be involved in metabolic pathways, ribosome, flavonoid biosynthesis, linoleic acid metabolism, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, aminoacyl-RNA biosynthesis, alpha-linoleic acid metabolism, biosynthesis of secondary metabolism, phenylpropanoid biosynthesis, RNA transport, glutathione metabolism, ascorbate andaldarate metabolism. The function correlation analysis results showed that 27 pathways correlated to 101 DEPs and 23 DEGs were identified in HR48/HR0, 15 pathways correlated to 147 DEPs and 16 DEGs were identified in HS48/HS0, 18 pathways correlated to 82 DEPs and 10 DEGs were identified in HR0/HS0, and 1 pathway correlated to 71 DEPs and 2 DEGs were identified in HR48/HS48. Candidate differential expression proteins closely related to insect resistance, such as trypsin inhibitor A-like, kunitz-type trypsin inhibitor, chalcone isomerase 4-like, lipoxygenase-9, alpha-dioxygenase 1-like, linoleate 9S-lipoxygenase 1-like isoform 1, lectin precursor, peroxidase 12-like, stress-induced protein SAM22, scorbate peroxidase 1, cytosolic, and so on. Finally, qRT-PCR analysis confirmed that the two kinds of “omics” results were reliable. 【】In this study, some proteins and metabolic pathways were related to insect-resistant, these differential proteins were directly or indirectly involved in soybean response to.

soybean;; transcriptomic; proteomic; correlation analysis

2017-11-03；

2017-12-18

國家重點研發計劃（2017YFD0101504）、廣西自然科學基金（2017GXNSFDA198037，2016GXNSFAA380238）、廣西農業科學院科技發展基金（桂農科2016JM03）

曾維英，E-mail：zengweiying_1981@163.com。

孫祖東，E-mail：sunzudong639@163.com