超高壓殺菌處理冷破碎獼猴桃果漿的條件優化及其貯藏期殺菌效果

楊天歌，鄧紅，李涵，孟永宏，雷佳蕾，馬婧，郭玉蓉

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超高壓殺菌處理冷破碎獼猴桃果漿的條件優化及其貯藏期殺菌效果

楊天歌，鄧紅，李涵，孟永宏，雷佳蕾，馬婧，郭玉蓉

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710062）

【】研究‘海沃德’獼猴桃冷破碎果漿的超高壓殺菌最優條件及超高壓處理后果漿貯藏過程中的殺菌效果，為獼猴桃的非熱加工及產品開發提供參考。【】采用冷破碎技術設備獲得獼猴桃純果肉果漿，以菌落總數、VC、褐變度等為評價指標，利用響應面分析建立模型，得到超高壓殺菌最優工藝條件；利用微生物學方法，研究超高壓處理的果漿在4℃、-20℃下貯藏期菌落總數、霉菌酵母和大腸桿菌的變化。【】通過單因素試驗和Box-Behnken模型響應曲面分析獲得超高壓殺菌的最佳條件為壓力497 MPa，溫度27℃，保壓時間24 min；在此條件下超高壓處理對果漿的菌落總數、大腸桿菌、霉菌酵母殺菌率分別達到73.18%、97.46%、100.00%。超高壓殺菌的冷破碎果漿于4℃、-20℃下貯藏6周、14周，在符合標準范圍內菌落總數的增量較大，與貯藏第1天相比分別達到97.19%、85.98%，但菌落總數增長速度不大；而果漿中的霉菌酵母、大腸桿菌的增量相對較少，且增殖也較慢；果漿中的霉菌酵母、大腸桿菌僅分別為1.36、0.67和0.32、0.35 lg（CFU/mL)。【】超高壓處理作為一種非熱殺菌方式對熱敏性的獼猴桃果漿有較好的殺菌效果。冷破碎果漿作為獼猴桃加工的中間原料在超高壓處理后于-20℃下貯藏14周依然符合商業無菌要求，因此低溫貯藏與超高壓殺菌結合有利于冷破碎果漿的貯藏和進一步加工利用。

獼猴桃；果漿；超高壓殺菌；響應曲面法；貯藏

0 引言

【研究意義】獼猴桃（）又名陽（羊）桃、藤梨，因其果實Vc含量豐富而被人們所熟知[1]。中國是獼猴桃的起源中心，資源豐富。獼猴桃不僅Vc含量很高，而且鉀、鈣、硒等微量元素也豐富；獼猴桃不僅可以預防癌癥、抗氧化、抗衰老，還能增強人體免疫力，預防失眠，對于脂肪細胞的分化也能起到一定的調節作用[2-3]。陜西省獼猴桃資源非常豐富，種植面積和產量均居全國第一；但獼猴桃果實系呼吸躍變型，極易霉爛變質[4]，鮮貯難度大且損失率高，必須對其進行加工處理。可國內獼猴桃的深加工及綜合利用普遍存在產品單一、技術水平含金量不夠、副產物浪費大、生產成本高等問題[5]，嚴重影響和制約了產業的發展。當前陜西普遍種植的‘海沃德’獼猴桃，其總酸含量高且顏色翠綠，非常適合作為加工品種以利于后續產品的精細開發。而果漿作為水果加工的中間產品，其生產和應用的歷史十分悠久，現在果漿作為休閑食品及軟飲料的原料也取得了空前的成功，將獼猴桃鮮果及時加工成果漿半成品已經成為了果蔬行業的共識[6]。但目前大多數獼猴桃加工中的殺菌方式以熱處理居多，熱殺菌雖然效果好，但是對獼猴桃的營養物質（如Vc等）的破壞很大，產品加工品質差，因而對熱敏性獼猴桃果漿的非熱殺菌及其效果的研究非常必要，對提升獼猴桃產業的加工技術水平有重要意義。【前人研究進展】國內外對冷破碎獼猴桃果漿的研究很少，李涵等[7]探討了冷破碎工藝制取獼猴桃果漿的優勢。前人對利用果漿制備產品的研究較多，如YONG等[8]探討了不同處理方法對‘海沃德’獼猴桃“Smoothie”類型飲料營養品質指標、抗氧化能力的影響。而超高壓技術已經廣泛應用于果蔬產品加工中，如BUTZ等[9]證明了超高壓處理可以最大程度保持鮮果的有益成分，又能殺滅病原菌和霉菌酵母。FERNANDEZ-SESTELO等[10]探討了高壓處理獼猴桃果漿后冷藏2個月的總體質量特性，發現高壓加冷藏可以延長獼猴桃果漿的保質期，同時可保持其整體品質。目前，國內外應用超高壓殺菌處理果汁相對較多。Jayathunge等[11]將經超高壓處理的番茄汁在較高的溫度下進行貯藏，并且對其微生物、色澤、抗氧化性等指標的變化進行了研究。【本研究切入點】文獻報道的超高壓殺菌研究大部分是針對獼猴桃果汁所進行的，研究獼猴桃果漿超高壓殺菌效果的較少，且對于超高壓處理冷破碎獼猴桃果漿的工藝條件及其貯藏中殺菌效果的研究幾乎空白。【擬解決的關鍵問題】本研究以果漿的褐變度、Vc含量、菌落總數3個指標進行加權作為綜合評價指標，利用Box-Behnken模型對‘海沃德’獼猴桃冷破碎果漿超高壓殺菌的主要參數進行優化，篩選出最佳殺菌條件，為實際生產中運用超高壓工藝對熱敏性的果漿進行殺菌提供試驗數據和技術指導；并在4℃和-20℃下貯藏經超高壓處理后的獼猴桃冷破碎果漿，研究果漿微生物變化，分析超高壓的殺菌效果，為獼猴桃果漿的進一步深加工利用和超高壓的生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘海沃德’獼猴桃于2016年8—9月采自陜西省周至獼猴桃創新實驗園，于1—3℃冷藏庫保存；選擇硬度為1.85—2.00 kg?cm-2的獼猴桃果實，利用冷破碎專利技術設備[12]得到獼猴桃冷破碎純果肉果漿。

平板計數瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、Baird-Parker瓊脂培養基、卵黃亞碲酸鉀增菌劑、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂、沙門氏菌顯色培養基，北京奧博星生物科技有限公司，生化試劑。其他化學試劑均為分析純。

1.2 設備與儀器

HPP600MPa-20L超高壓處理裝置（包頭科發高壓科技有限責任公司）；DH-001型冷破碎設備（西安鼎合機械制造公司）；722型可見分光光度計（上海市光譜儀器有限公司）；3k30超高速低溫離心機（美國Sigma公司）；SHZ-82水浴振蕩器（金壇富華儀器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程 選擇八分成熟的獼猴桃果實，剔除病蟲果和腐敗果，先水洗去泥沙、污物，再用流水沖洗，瀝干備用。然后將整果投入冷破碎專利設備中，按照設備說明書調整運行參數使果肉與果皮果籽分離，得到獼猴桃果肉果漿。包裝后使用超高壓設備，設置一定的壓力、溫度和時間對獼猴桃果漿進行滅菌，經超高壓滅菌的果漿分別在4℃、-20℃貯藏6周和14周，對兩種貯藏條件下果漿的綜合指標進行分析測定。

1.3.2 超高壓殺菌試驗評價指標的建立 為使果漿在達到國家衛生標準的同時，保證殺菌對其營養指標、外觀指標的影響最小，根據GB/T 31121—2014[13]和GB17325—2015[14]自行制定綜合指標評價超高壓殺菌的獼猴桃果漿的品質。根據國標的要求，首先要達到衛生標準，其次是品質和外觀的要求。因此結合企業生產過程中的需要[15]，選擇了獼猴桃果漿中含量較高的Vc、影響果漿外觀的褐變度[16]及菌落總數等進行加權（菌落總數所占權重為70%，營養指標Vc和外觀指標褐變度所占權重均為15%）作為評價超高壓殺菌獼猴桃果漿的綜合指標計算得分，具體評分情況如表1。

表1 超高壓殺菌獼猴桃果漿綜合評分表

綜合評分越高說明品質越好The higher of the score, the better the quality of pulp

1.3.3 超高壓殺菌單因素試驗 影響超高壓殺菌效果的主要參數是壓力、保壓時間、溫度。因此本試驗通過改變壓力（200、300、400、500和600 MPa），保壓時間（10、15、20、25和30 min），溫度（23、25、27、29和31℃）來探究各因素對超高壓殺菌后獼猴桃果漿綜合指標的影響。

1.3.4 響應面優化超高壓殺菌試驗條件 在單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behnken模型，以壓力A、溫度B和保壓時間C為自變量（分別以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高三個水平，即壓力400、500、600 MPa，溫度25、27、29℃，保壓時間20、25、30 min），以綜合評價得分Y為響應值，進行超高壓殺菌條件的優化。

1.3.5 超高壓殺菌果漿指標的分析

（1）菌落總數的測定 采用GB 4789.2—2010[17]進行檢測，參考GB 7101—2015[18]和GB17325—2015[14]，綜合制定果漿的菌落總數標準：菌落總數≤2 lg cfu/mL。

（2）褐變度的測定 參考文獻[15]進行分析。

（3）Vc的測定 參照國標[19]測定，根據式（Ⅰ）計算樣品中Vc的含量。（Ⅰ）式中：V—滴定樣液時消耗染液的體積（mL）；V0—滴定空白時消耗染液的體積（mL）；T—2,6-二氯靛酚溶液滴定度（mg·mL-1）；A—稀釋倍數；W—樣品重量（g）。

1.3.6 果漿貯藏期主要微生物指標的檢測 根據GB 7101—2015[18]和GB 17325—2015[14]選定菌落總數≤2 lg cfu/mL、霉菌酵母≤2 lg cfu/mL、大腸桿菌≤1 lg cfu/mL、金黃色葡萄球菌與沙門氏菌不得檢出，作為果漿微生物指標合格的標準。（1）菌落總數的測定：同1.3.5（1）。（2）霉菌酵母的測定：根據GB 478915—2010[20]檢測。（3）大腸桿菌的測定：根據GB 4789.38—2012[21]第二法測定。（4）金黃色葡萄球菌的測定：根據GB 478910—2010[22]第二法測定。（5）沙門氏菌的測定：根據GB 47894—2010[23]進行測定。

1.4 數據統計分析方法

每個試驗均重復3次，結果以均值±標準差表示；采用DPS軟件及Design-Expert10.0軟件處理試驗數據。

2 結果

2.1 超高壓殺菌冷破碎獼猴桃果漿的單因素試驗結果

2.1.1 壓力對超高壓殺菌冷破碎果漿綜合指標的影響 溫度25℃、保壓時間20 min，不同壓力殺菌對果漿綜合指標的影響如圖1-A所示。果漿的綜合指標的數值隨著壓力的增大呈現先降低再升高，最后下降的趨勢。壓力為200和300 Mpa時，菌落總數指標均超過了國家衛生標準，且菌落總數變化不大，所以這兩個點的綜合評分與400、500和600 Mpa有較大差距。壓力的大小與菌落總數的對數值成反比關系[24]。試驗發現果漿中Vc的含量隨壓力的升高，略有下降，尤其是當壓力大于500 Mpa后，Vc下降顯著，但褐變度幾乎無變化。Vc含量的減少有研究報道是因為在超高壓處理時，將外界的氧氣壓入了食品體系中，使食品體系的活性氧增加，同時加速了其與Vc的氧化[25]。Vc的變化趨勢與許秀舉等[26]的研究結果基本一致。因此，壓力從200 Mpa升高到300 Mpa時，綜合評分呈現下降趨勢的主要原因是Vc含量的下降。綜合考慮對果漿Vc、褐變度、菌落總數的影響，選擇壓力500 Mpa為宜。

2.1.2 保壓時間對超高壓殺菌冷破碎果漿綜合指標的影響 溫度25℃、壓力500 Mpa時不同保壓時間殺菌對果漿綜合指標的影響如圖1-B。超高壓殺菌果漿綜合評分數值隨保壓時間的增長先升高后下降，當保壓時間為25 min時，綜合評分達到最高值。試驗發現，菌落總數隨著時間的增長不斷減少，但在保壓25 min以后，菌落總數基本維持不變，當保壓時間達到20 min時，果漿的衛生指標即可達到國家標準。褐變度在此過程中基本沒有變化，Vc含量的變化情況類似于壓力對其的影響。果漿的VC和色澤隨著時間延長劣變，綜合考慮對這3個方面的影響，選擇保壓時間為25 min。

2.1.3 溫度對超高壓殺菌冷破碎果漿綜合指標的影響 保壓時間25 min、壓力500 Mpa時，不同溫度條件下殺菌對果漿綜合指標的影響如圖1-C所示。因為獼猴桃是熱敏性的水果，所以高壓殺菌時選擇較低溫度進行試驗；又要保證非熱殺菌，因此結合實際情況，選擇超高壓殺菌溫度為23—31℃。由圖1-C可知，隨著溫度的提高，綜合評分先緩慢升高后呈現下降趨勢，菌落總數隨溫度升高，先略有下降后上升，當溫度為31℃時，菌落總數達最高值1.2 lg cfu/ml，這可能是由于‘海沃德’獼猴桃中存在較多嗜溫菌，30—40℃最適宜其生長。Vc含量隨著溫度的上升而降低，這是因為溫度的提高使部分Vc分解。褐變度隨溫度的升高而變大，這是由于低溫可以降低有關酚類物質的氧化速度[27]。綜合選擇超高壓殺菌溫度27℃。

小寫字母a、b、c表示差異顯著（P＜0.05） a, b, c indicate significant difference (P＜0.05)

2.2 響應面優化冷破碎獼猴桃果漿的超高壓殺菌條件

響應面優化超高壓殺菌條件試驗結果見表2。利用Design-Expert10.0軟件對表2所得的試驗數據進行回歸分析，得到的二次多元回歸模型：=9.47-0.19- .038+0.16+7.500-003+0.34+0.078-1.752-0.742-0.352（-綜合評分，-壓力，-溫度，-保壓時間）。對所得模型進行方差分析結果如表2所示，可知回歸模型具有極度顯著性（＜0.0001），2和Adj2分為0.9878和0.9720，表明方程對試驗的擬合度比較好，pred2為0.8450，說明該模型預測良好。失擬項具有不顯著性（=0.0921＞0.05），說明回歸方程與實際結果擬合效果很好，可用來推測試驗結果。該模型還反映出因素、對影響顯著，、2對的影響高度顯著，2、2對的影響為極度顯著，、、對的影響不顯著。由值可知各因素影響綜合評分的順序為：壓力＞保壓時間＞溫度。而各因素之間的交互作用見響應曲面圖（圖2），由圖可知，壓力與溫度以及溫度與保壓時間的交互作用不顯著，壓力與保壓時間交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

2.3 工藝優化與驗證試驗

通過Design-Expert10.0軟件得到果漿超高壓殺菌的最佳條件為：壓力496.67 Mpa，溫度26.80℃，保壓時間 23.74 min，綜合評分的理論預測值為9.461，結合實際生產修正參數為：壓力497 Mpa，溫度27℃，保壓時間24 min，進行3組驗證試驗，綜合評分為9.532±0.15，與模型預測值誤差為0.72%，說明該模型的預測性較好，優化的殺菌工藝可靠。

2.4 超高壓處理的獼猴桃冷破碎果漿在貯藏期內微生物指標的變化

在4℃、-20℃下貯藏經超高壓殺菌處理的獼猴桃果漿，其微生物指標的變化如圖3所示。由圖3可知，與對照相比，超高壓殺菌對獼猴桃果漿菌落總數的殺菌率為73.18%，但在4℃、-20℃貯藏6周、14周果漿菌落總數變化顯著，增長了97.19%、85.98%；超高壓殺菌果漿貯藏6周（4℃）、14周（-20℃）菌落總數分別為2.11 lg（CFU/mL）和1.99 lg（CFU/mL）。超高壓對霉菌酵母的殺菌率達到100%，且在3周內未檢測出霉菌酵母，4℃、-20℃貯藏6周、14周僅為1.36 lg（CFU/mL）、0.67 lg（CFU/mL）；超高壓對大腸桿菌的殺菌率達到97.46%；果漿在4℃、﹣20℃下貯藏6周和14周的大腸桿菌數的增殖也未超出標準。冷破碎果漿在整個貯藏期內均未檢測出金黃色葡萄球菌與沙門氏菌，說明原料不存在這兩種致病菌。

圖 2 因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖

表2 響應面試驗結果與方差分析

表中綜合評分結果為3次重復試驗的平均值；*顯著（＜0.05），**極顯著（＜0.01），***極度顯著（＜0.0001）

The results of the comprehensive evaluation score in the table are the average of three replicates. * Significant differences (＜0.05), ** Very significant differences (＜0.01), *** Extremely significant differences (＜0.0001)

同組數據小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）The lowercase letters in same team indicate significant difference (P＜0.05)

3 討論

3.1 獼猴桃冷破碎果漿的超高壓殺菌條件

超高壓技術在獼猴桃加工中的應用目前主要是針對獼猴桃果汁（30℃，400 Mpa，15 min）[28]、果肉飲料（400—500 Mpa，10 min）[29]等進行殺菌處理，在獼猴桃果漿中尚無應用。獼猴桃果汁是以獼猴桃果為原料，利用機械等物理方法制成的可發酵但未發酵的汁液制品；或在濃縮果汁中加入其加工過程中除去的等量水分復原制成的汁液制品。獼猴桃果漿是以獼猴桃果為原料，利用物理方法制得的可發酵但未發酵的漿液制品；或在濃縮果汁中加入其加工過程中除去的等量水分復原制成的漿液制品。其果肉飲料是用果漿和水為原料，加糖、酸味劑等加工制成的制品[13]。本研究確定的超高壓殺菌處理獼猴桃冷破碎果漿的工藝參數（497 Mpa，27℃，24 min），與獼猴桃其他產品的超高壓殺菌條件研究結果不太一致，綜合比較前人的研究，說明不同狀態的產品由于水分活度的不同[15]，殺菌條件具有一定差異。

3.2 超高壓殺菌對獼猴桃冷破碎果漿的殺菌效果

超高壓殺菌主要是通過影響細菌細胞膜的流動性和滲透性破壞大多數細菌的細胞膜,從而改變細胞膜的部分功能,最終導致細胞死亡[30]。盡管超高壓殺菌果漿中微生物滿足商業無菌[31]要求，可是相比于傳統熱殺菌處理（90℃、30 s）[32]，其殺菌效果對霉菌酵母比較理想，但對菌落總數、大腸桿菌的殺滅率未能達到100%。原因在于霉菌酵母的耐壓性比細菌（革蘭氏陰性菌）的耐壓性低，革蘭氏陰性菌耐壓性又比革蘭氏陽性菌低。芽孢（內生孢子）對物理處理（熱、UV輻照、干燥、放射等）和化學處理具有非常高抵抗性的休眠形式,在生理和形態上均與營養細胞不同[33]。而且，芽孢比較耐壓，尤其是革蘭氏陽性菌中的芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬的芽孢最為耐壓。加熱和加壓結合是殺死孢子的一種有效方法，加熱可以降低超高壓處理的壓力或縮短處理時間。高壓下，芽孢被完全鈍化需要在75℃、827 MPa下處理30 min[34]。研究還發現微生物的耐壓性還與食品的組成有關。細菌在蛋白質和鹽分濃度高時，其耐壓性就高，并隨營養成分的豐富耐壓性有增高的趨勢,因此，超高壓對不同細菌的致死作用效果不同。由于超高壓是一種將微生物殺死和抑制活性共同存在的殺菌方式，所以有些耐壓菌會經過自我修復后，重新恢復生長繁殖能力[35]，因而超高壓這種殺菌方式有其局限性。本研究顯示，超高壓雖然對于霉菌酵母殺滅率達到100%，但是超高壓未使其孢子受到嚴重損傷，經過一段時間恢復，霉菌酵母的增殖還大于大腸桿菌，因此，超高壓殺菌對果漿大腸桿菌孢子的致死效果相對比較好。以后還需要針對不同原料進行深入研究，探討超高壓對各種微生物菌群的致死效果，并結合其他技術[28]以充分發揮非熱殺菌的優勢和應用潛力。

4 結論

利用超高壓技術在試驗確定的最佳工藝條件（497 Mpa、27℃、24 min）下殺菌處理‘海沃德’獼猴桃冷破碎果漿，殺菌效果比較顯著，對菌落總數、大腸桿菌、霉菌酵母的殺滅有效率分別達到73.18%、97.46%、100%；超高壓與低溫貯藏結合對熱敏性物料獼猴桃果漿保存效果良好，但隨著貯藏時間的延長，超高壓殺菌的獼猴桃冷破碎果漿，其菌落總數增殖較快，大腸桿菌、霉菌酵母也有一定比例的增殖，說明單獨使用超高壓處理獼猴桃冷破碎果漿不能完全殺死微生物孢子，還需要與其他方法協同來發揮超高壓非熱殺菌的優勢。低溫貯藏與超高壓殺菌結合有利于冷破碎果漿的貯藏和進一步加工利用。

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（責任編輯 趙伶俐）

Optimization of Ultra-high Pressure Sterilization Conditions on the Kiwi Fruit Pulp Produced by Cold Crushing Method and its Sterilization Effect During Storage Period

YANG TianGe, DENG Hong, LI Han, MENG YongHong, LEI JiaLei, MA Jing, GUO YuRong

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062)

【】The optimum conditions of ultra-high pressure (UHP) sterilization for kiwi fruit pulp and the effects of sterilization during storage period after ultrahigh pressure treatmentwere investigated by using Hayward Kiwifruit as raw materials. This study will provide an experimental reference for the non-thermal processing of kiwi fruit and its products development. 【】The kiwi fruit pulp was obtained by cold crushing technology, the response surface method (RSM) was used to establish the mathematical model of ultra-high pressure sterilization conditions for kiwi fruit pulp to obtain the optimum conditions, and the total number of colonies, Vitamin C and browning degree were used as the evaluation indexes. The changes of the total number of colonies, mold and yeast andgroup of kiwi fruit pulp were studied with microbiological analysis methods during the storage period at temperatures of 4℃ and -20℃ after ultrahigh pressure treatment. 【】The optimum sterilization conditions of UHP treatment on kiwi fruit pulp were pressure 497 MPa, temperature 27℃, holding time 24 min through the single factor test and the response surface analysis of Box-Behnken model. Under this optimal sterilization condition, the total lethality rates of total number of colonies,group and mold and yeast were 73.18%, 97.46% and 100.00%, respectively, in kiwi fruit pulp after UHP treatment. Under the standard range, the increments of total number of colonies in kiwi fruit pulp was bigger, which increased significantly of 97.19% and 85.98% respectively after storage for 6 and 14 weeks at 4℃, -20℃, compared with the first day of storage, but the growth rate of total number of colonies was small. While the increments rates ofgroup, mold and yeast in kiwi fruit pulp after UHP treatment were relatively small, the content ofgroup, mold and yeast only was 1.36, 0.67 and 0.32, 0.35 lg (CFU/mL) after stored 6 and 14 weeks at 4℃, -20℃, respectively. 【】As a new type of non-thermal sterilization method, ultra-high pressure technology had good sterilization effects for the heat sensitivity materials of kiwi fruit pulp. The kiwi fruit pulp which was used as processing materials and sterilized by the ultra-high pressure technology could be stored 14 weeks at -20℃ still to meet the commercial aseptic requirements, so the ultra-high pressure sterilization combined with the low temperature storage will benefit the further storage, process and utilization of kiwi fruit pulp produced by cold crushing.

kiwi fruit; pulp; ultrahigh pressure sterilization; response surface method; storage

2017-08-23；

2017-11-21

國家重點研發計劃（2017YFD0400700）、農業部產業體系項目（CARS-28）、陜西省科技廳項目（2016KTCL02-34）

楊天歌，Tel：15829697687；E-mail：15829697687@163.com。

鄧紅，Tel：13572932286；E-mail：hongden@snnu.edu.cn。通信作者孟永宏，Tel：13659196911；E-mail：mengyonghong@snnu.edu.cn