家蠶glial cell missing(BmGcm)基因鑒定、表達、亞細胞定位和功能

張奎，潘光照，蘇晶晶，談娟，徐曼，李鈺添，崔紅娟

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家蠶()基因鑒定、表達、亞細胞定位和功能

張奎，潘光照，蘇晶晶，談娟，徐曼，李鈺添，崔紅娟

（西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400716）

【】鑒定、克隆家蠶（）()基因，分析其mRNA表達及亞細胞定位特征。制備多克隆抗體，同時在細胞水平進行過表達，檢測gcm對細胞增殖和周期的影響，為探究Bmgcm功能打下基礎?！尽坷肦ACE方法克隆獲得全長cDNA序列，利用ORF Finder和SMART等在線工具對基本序列特征和結構信息進行分析，運用Clustalx 和MEGA 6.0等軟件對多物種gcm蛋白進行同源序列比對和進化分析。采用RT-PCR和qRT-PCR方法檢測的表達情況。利用原核表達系統獲得重組蛋白，通過蛋白純化和免疫小鼠制備多克隆抗體，運用Western blot對抗體進行檢測。構建Bmgcm表達載體，轉染家蠶胚胎細胞系，分析其亞細胞定位情況，同時利用EDU細胞增殖標記和流式細胞儀對其功能進行探索。【】（BGIBMGA006182）定位于4號染色體的nscaf2847上，其基因全長 4 046 bp，包含4個外顯子和3個內含子。其cDNA全長1 734 bp，包含166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整開放閱讀框(ORF)。該基因編碼446個氨基酸殘基，預測蛋白分子量為50.61 kD，等電點5.557，含有典型的GCM結構域。多重比對結果顯示GCM結構域在不同物種間具有高度的保守性，進化分析顯示昆蟲gcm蛋白單獨聚為一支，其中Bmgcm蛋白與帝王蝶同源蛋白親緣關系最為接近。表達分析結果顯示在胚胎發育第4天表達達到峰值，隨后表達水平逐漸下調，而在幼蟲階段，主要表達于中腸、精巢和卵巢。將完整的開放閱讀框序列構建至原核表達系統，經IPTG誘導和親和層析純化獲得高純度重組蛋白，通過免疫小鼠獲得了多克隆抗體，Western blot檢測該抗體可以特異性識別重組蛋白。在家蠶細胞系中過表達Bmgcm蛋白，結果顯示其定位于細胞核。在細胞水平，過表達會明顯抑制細胞增殖，將細胞周期阻滯于G1/S期。【】克隆鑒定得到全長序列，獲得其表達和亞細胞定位信息。通過原核表達、蛋白純化和免疫小鼠制備了可用的多克隆抗體。細胞實驗發現可以顯著抑制增殖和影響正常的細胞周期進程。

家蠶基因()；克隆；表達分析；抗體制備；過表達

0 引言

【研究意義】 Glial cell missing（gcm）與神經發育密切相關，調控果蠅膠質細胞的生成[1-2]，同時gcm通過與多種因子，如GATA和lozenge的相互作用，調控漿細胞的生成、復制和成熟等過程[3]。研究家蠶（）有助于解析該基因在家蠶神經發育和造血調控中的功能，為推動家蠶模式化作出貢獻?！厩叭搜芯窟M展】Gcm是一小類調控轉錄因子，其N端含有一個長度約為150個氨基酸殘基的保守GCM結構域基序[4]。首先在果蠅中被鑒定出來，可以直接調控神經元前體細胞分化為膠質細胞，是膠質細胞生成主要調控因子[1-2,5-6]。其功能缺失會導致神經膠質細胞的完全缺失，而過表達則可以激活repo和pnt等相關轉錄因子[7-8]，進而誘導與膠質細胞發育相關基因的表達[9-11]，促進膠質細胞生成，此外通過激活ttk抑制神經元的形成[12-13]。而在哺乳動物中，是胎盤發育所必需的，參與調控滋養層細胞的分化[14-15]。而另一個基因與甲狀旁腺發育相關[16]，發生突變會引發甲狀旁腺功能減退癥[17]。在果蠅造血中也發揮著重要的調控作用[3]，能夠促進漿細胞的發生，而抑制結晶細胞生成。/的缺失會導致漿細胞數量明顯減少，結晶細胞的數量增多，異位表達能夠誘導漿細胞特異性分子標記基因的表達[18]。除調控血細胞與神經膠質細胞外，果蠅同時也參與調控腱細胞的分化[15]。的結構及其調控作用具有高度的保守性，果蠅和的缺失會致死，而在人中，主要參與調控胎盤和甲狀旁腺，而這兩個組織在果蠅中是不存在的[19-20]，說明的功能在不同物種間存在一定的差異[21]?！颈狙芯壳腥朦c】家蠶作為一種經典的鱗翅目昆蟲代表，其在生物反應器、蠶絲纖維材料和模式生物等方面顯示出廣闊的前景[22]。目前已經在果蠅中鑒定出兩個同源基因，對其功能進行了詳細的解析[3,23]。而在家蠶中，還未見關于的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】通過生物信息學分析和RACE技術鑒定克隆，分析其序列和表達特征。利用原核表達、蛋白純化和免疫小鼠制備多克隆抗體，在細胞水平研究Bmgcm蛋白的亞細胞定位，對其功能進行探索。

1 材料與方法

試驗于2015年9月至2017年3月在家蠶基因組生物學國家重點實驗室（西南大學）完成。

1.1 材料與試劑

供試家蠶品系為大造，取自西南大學家蠶基因資源庫，在正常條件下進行催青和飼養。細胞系BmE-SWU3由筆者實驗室建立并保存[24]。RNAiso、PMD19-T simple、限制性內切酶和T4連接酶購自TaKaRa公司，HiFi酶和DNA Marker購自Transgen公司，反轉錄試劑盒購自Promega公司，Click-iT? EdU Imaging Kits購自Invitrogen公司，膠回收試劑盒購自Axygen公司，RACE試劑盒、BrdU、熒光二抗和細胞爬片購自Invitrogen公司，轉染試劑NDE3000由重慶高圣醫藥提供。質粒DNA試劑盒購自Qiagen公司，Tubulin抗體、DAPI和抗熒光淬滅劑購自碧云天，ECL顯色試劑盒購自Thermo scientific公司，測序和所有引物的合成均在華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 胚胎1—9 d和5齡3 d各組織，包括表皮、頭部、中腸、絲腺、精巢、卵巢、脂肪體、血細胞和整蠶等材料，除血細胞直接加入RNAiso外，其他材料在液氮中研磨為粉末后加入RNAiso，提取總RNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別對RNA的完整性純度和濃度進行檢測。參照反轉錄試劑盒說明書反轉錄得到cDNA模板。

1.2.2 全長克隆 以黑腹果蠅（）的gcm蛋白作為質詢序列，通過檢索比對家蠶數據庫SilkDB（http://silkworm.genomics.org.cn/）和KAIKObase（http://sgp.dna.affrc.go.-jp/KAIKObase/）獲得家蠶同源基因，設計特異性引物并進行PCR擴增，獲得部分中間序列。然后設計RACE擴增特異引物GSP1、NGSP1、GSP2和NGSP2（表1），參照RACE試劑盒提供的方法步驟進行5′和3′ RACE擴增。所有PCR產物經切膠回收并連接至pMD19-T-simple載體后進行測序。利用BioEdit軟件對測序結果進行拼接，最終獲得全長cDNA序列。為了驗證RACE結果的準確性，設計了全長cDNA引物并進行PCR擴增。

1.2.3 蛋白序列分析 利用在線工具ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對的表達框ORF進行預測，獲得推導的氨基酸序列。利用在線軟件SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）對信號肽基序進行預測，利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對蛋白結構特征進行研究，蛋白質分子量和等電點運用Isoelectric point calculator（http://isoelectric.ovh.org/）進行預測。將全長cDNA序列作為質詢序列，比對家蠶基因組數據庫，獲得基因組DNA信息，利用在線工具Splign（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign. cgi?textpage=online&level=form）對基因外顯子和內含子分布進行分析。

1.2.4 進化分析 從NCBI下載包括智人（）、小鼠（）和黑腹果蠅等多種物種在內的gcm蛋白序列，通過Clustalx軟件對這些蛋白序列進行比對，將比對結果導入MEGA 6.0軟件，以NJ （neighbor-joining）法構建進化樹，重復次數為1 000次。

1.2.5 PCR擴增 以胚胎1—9 d和5齡3 d各組織cDNA為模板，對進行PCR擴增檢測，以肌動蛋白3（Actin3）為內參（引物序列見表1）。PCR擴增反應體系：模板100 ng，10×PCR buffer 2.5 μL，2 mmol·L-1dNTPs 2 μL，20 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，HiFi-Taq酶0.2 μL，最終加ddH2O至總體積為25 μL。反應體系配制完成并瞬時離心后置入PCR儀進行擴增，擴增條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，共30個循環；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產物經瓊脂糖電泳、EB染色和成像后對表達情況進行分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR所用試劑為TaKaRa公司的SYBR?Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），所用儀器為Applied Biosystems公司的StepOne PlusTMReal-Time PCR system。定量所用引物見表1，其中以家蠶為內參。定量PCR的反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃結合與延伸30 s，循環數為40次。

1.2.7 原核表達、蛋白純化與抗體制備利用表達框ORF全長引物擴增得到Bmgcm的片段，經R I和I酶切后連接至經同樣限制性內切酶處理的pET32a載體中，命名為pET32a-gcm。測序驗證后轉化至大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態，挑取單菌落，利用PCR技術檢測目的質粒是否導入菌體。將陽性克隆接種至LB 培養基，于37℃，220 r/min振蕩培養。至OD值達到0.6—1.0時，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol·L-1，然后分別置于16、25和37℃進行誘導，誘導時間分別為20、12和4 h，其中以不加IPTG為對照。誘導完成后，低溫離心棄上清，收集菌體，用PBS清洗菌體數次重懸于PBS，利用高壓破碎儀進行破碎至菌液透亮。高速冷凍離心后分別收集上清蛋白和包涵體蛋白，取8 μL蛋白樣品加入2 μL 5×SDS PAGE上樣緩沖液，混合均勻后100℃水浴變性30 min。隨后將樣品注入SDS-PAGE膠進行電泳，經考馬斯亮藍染色后對蛋白的表達情況進行觀察。經過比較，最終選擇IPTG終濃度為0.6 mmol·L-1，誘導溫度為16℃，誘導時間為20 h進行大規模誘導表達gcm重組蛋白，經Ni+親和層析法純化后獲得純度較高的重組蛋白。用純化的重組蛋白免疫昆明鼠，第1次取50 μg蛋白和等體積的弗氏完全佐劑混合，完全乳化后腹腔注射；第2、3、4次分別取75、100和125 μg蛋白和等體積的弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后腹腔注射，每次間隔為10 d。最后一次直接注射150 μg蛋白，3 d后摘取小鼠眼球取血，經梯度離心獲得抗血清，加入25%滅菌甘油后分裝保存于-80℃。

1.2.8 過表達載體的構建及細胞轉染 通過gcm-CDS引物擴增得到全長ORF序列片段，根據完整的閱讀框序列設計特異性過表達引物，將片段利用I和I酶切后連接至PIZ-OpIE2-GST-DsRed-SV40載體[25]，轉化后挑取陽性克隆，測序驗證后用于下一步試驗，命名為PIZ-OpIE2- BmGcm-GST-DsRed-SV40和PIZ-OpIE2-GST-DsRed- BmGcm-SV40，其中gcm與GST-DsRed在同一讀碼框下，共同形成融合蛋白。將無菌玻片鋪于24孔細胞培養板，細胞鋪板1 d后用無抗Grace培養基培養。轉染方法參照談娟等[26]的報道，即在超凈工作臺中將0.5 μg PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed-SV40或PIZ- OpIE2-GST-DsRed-BmGcm-SV40質粒添加至100 μL Grace培養基（不抗生素和血清）并輕柔混合均勻，然后加入1.5 μL脂質體并混勻，室溫靜置30 min后將混合液加入24孔板，6 h 后換液。轉染3 d后，一部分孔直接收集細胞進行Western blot檢測，另外一部分經多聚甲醛固定和DAPI染色后進行熒光觀察。

表1 引物序列

為了提高轉染效率，利用限制性內切酶Ⅰ和Ⅰ將PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed-SV40載體中的GST-DsRed元件切除，通過載體自連獲得表達Bmgcm蛋白的載體，命名為PIZ-OpIE2-BmGcm- SV40。利用同樣的方法轉染細胞，于轉染3 d后進行EDU標記檢測、Western blot和流式分析，同時收集RNA材料，用于定量檢測。

2 結果

2.1 Bmgcm克隆

以智人、小鼠和黑腹果蠅等物種的gcm同源蛋白序列在家蠶數據庫中比對到一個高度相似的同源基因，編號為BGIBMGA006182。該基因定位于4號染色體的nscaf2847上，NCBI登錄號為XP_004929375.2。根據預測序列設計引物進行PCR擴增，得到了長度約為1 200 bp的序列。利用RACE技術，擴增得到長度約為500 bp的5′ RACE產物和長度約為450 bp的3′ RACE產物。根據軟件拼接得到的全長序列，設計全長引物，成功擴增得到，證實RACE結果的準確性。基因組DNA全長4 046 bp，由4個外顯子和3個內含子構成（圖1）。該基因cDNA全長序列為1 734 bp，其中包含一個166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整開放閱讀框（ORF），在3′ UTR末端有一個polyA尾（圖1）。其cDNA全長編碼446個氨基酸殘基，其預測蛋白分子量為50.61 kD，等電點為5.557。

黑色框表示外顯子，黑線表示內含子 Exons and introns are represented by black frames and black lines, respectively

2.2 Bmgcm蛋白結構域分析

利用在線工具SMART（http://smart.embl- heidelberg.de/）對Bmgcm推導的氨基酸序列進行分析，結果顯示在23—163氨基酸之間存在一個典型的GCM結構域。

2.3 序列比對分析

下載帝王蝶（，DpGcm，EHJ73156.1)、黑腹果蠅（DmGcm，BAA10905.1和DmGcm2，BAB83120.1）以及智人（HsGCMa，NP_003634.2和HsGCMb，NP_004743.1）相應的gcm蛋白序列，與Bmgcm蛋白進行序列比對分析，結果顯示這些蛋白在GCM結構域部分具有高度的保守性，而在其他部分差異較大（圖2-A）。單獨分析GCM結構域的相似性，結果表明Bmgcm蛋白的GCM結構域與帝王蝶DpGcm、黑腹果蠅DmGcm、DmGcm2、智人HsGCMa、HsGCMb的序列相似度分別為95%、72%、69%、57%和68%（圖2-B）。

2.4 Bmgcm進化分析

使用MEGA 6.0軟件，利用NJ法構建包括家蠶在內的多物種gcm蛋白序列進化樹，結果顯示脊椎動物和無脊椎動物gcm蛋白分別位于不同的分支上，高等生物如智人和小鼠中均存在兩種Gcm蛋白，即GCMa和GCMb，分別構成脊椎動物中的兩個分支（圖3）。選取了包括棘皮動物、軟體動物和節肢動物等多種低等生物進行聚類分析，發現具有很強的規律性，其中家蠶Gcm蛋白與其他昆蟲的同源蛋白聚為一類。在大部分昆蟲中，雙翅目（如岡比亞按蚊、埃及伊蚊、黑腹果蠅和家蠅等）中存在兩個同源基因，而在鞘翅目（如赤擬谷盜）、膜翅目（如木蟻、印度跳蟻和麗蠅蛹集金小蜂等）和鱗翅目（如帝王蝶和家蠶）等昆蟲中只發現一個。

2.5 Bmgcm表達分析

利用RT-PCR和熒光定量PCR技術檢測了在胚胎各時期的表達情況，結果顯示其在胚胎第1、2天有表達，第3天時高表達，第4天達到峰值，隨后表達水平逐漸降低（圖4-A、4-C）。同時，檢測了5齡3 d幼蟲各組織中的表達情況，結果顯示在中腸、精巢和卵巢中有表達，而在脂肪體有微弱的表達（圖4-B、4-D）。

A：Bmgcm蛋白與其他物種同源蛋白比對分析 Alignment analysis of Bmgcm protein with its homologous protein from other species；B：不同物種gcm蛋白GCM結構域相似性分析Similarity analysis of the GCM domain from various species。保守的半胱氨酸和組氨酸殘基用星號標記Conserved cysteine and histidine residues are marked with asterisks

圖3 家蠶與其他物種gcm的系統進化分析

A、C：Bmgcm在胚胎時期的表達 The expression profile of Bmgcm at embryonic development stage；B、D：Bmgcm在幼蟲各組織中的表達 The expression profile of Bmgcm in different tissues at larval stage。Ep：表皮 Epidermis；He：頭部Head；Mi：中腸Midgut；Ma：馬氏管 Malpighian tubules；Si：絲腺Silk gland；Te：精巢Testis；Ov：卵巢Ovary；Fa：脂肪體Fat body；Ha：血細胞Haemocyte；Wh：整蠶Whole body

2.6 Bmgcm原核誘導、蛋白純化及抗體制備

選擇全長序列，經PCR擴增后連接至pET32a質粒，重組質?？梢员籖 I和I酶切開，測序發現無突變，證明構建的pET32a-gcm質粒是成功的（圖5-A）。將pET32a-gcm轉化至大腸桿菌Rosseta (DE3)感受態細胞中，獲得重組蛋白表達菌株。在0.6 mmol·L-1IPTG的誘導下，檢測溫度對蛋白表達的影響，發現25℃誘導蛋白表達的產量最高（圖5-B），所以在后續試驗中選擇此條件進行大規模的誘導表達。經過鎳離子親和層析純化，獲得了純度較高的重組蛋白（圖5-C）。通過免疫小鼠，最終獲得了抗gcm血清，Western blot檢測結果表明該抗體可以特異性識別外源重組Bmgcm蛋白（圖5-D）。

A：pET32a-gcm原核表達載體的鑒定 The construction of the PET32a-gcm plasmid。M：DNA分子標準 DNA marker；1：gcm擴增產物 PCR product of gcm；2：PET32a質粒 pET32a vector；3：pET32a-gcm重組質粒pET32a-gcm recombinant plasmid；4：pET32a-gcm質粒酶切驗證 Restriction enzyme digestion analysis of PET32a-gcm plasmid。B：Bmgcm在大腸桿菌中的表達 Induction of Bmgcm protein in E. coli。M：蛋白分子標準 Protein marker；1：未誘導重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli without induced by IPTG；2：未誘導重組菌包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli without induced by IPTG；3：16℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 16℃；4：16℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 16℃；5：25℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 25℃；6：25℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 25℃；7：37℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 37℃；8：37℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 37℃。C：Bmgcm重組蛋白純化 Purification of Bmgcm recombinant protein。M：蛋白分子標準 Protein marker；1：純化得到的包涵體蛋白Purified Bmgcm protein。D：Bmgcm抗體Western blot檢測Bmgcm antibody detection with Western blot。1：菌體蛋白 Bacterial protein；2：純化得到的包涵體蛋白 Purified Bmgcm protein

2.7 Bmgcm蛋白亞細胞定位

將Bmgcm完整的表達框構建至PIZ-OpIE2-GST- DsRed-SV40載體上，獲得PIZ-OpIE2-BmGcm-GST- DsRed和 PIZ-OpIE2-GST-DsRed-BmGcm質粒，分別表達BmGcm-GST-DsRed和GST-DsRed-BmGcm兩種融合蛋白（圖6-A）。轉染家蠶BmE-SWU3細胞系3 d后，進行固定和DAPI染色。熒光顯微觀測結果顯示對照質粒EGFP 陽性信號均勻分布于細胞質中，而重組質粒EGFP 信號則只存在于細胞核中（圖6-B），說明Bmgcm蛋白與其他物種同源蛋白一樣，定位于細胞核，是一類核蛋白。

A：載體構建策略 The strategy for constructing vector。B：細胞轉染PIZ-OpIE2-GST-EGFP、PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed和PIZ-OpIE2-GST- DsRed-BmGcm質粒后觀察 The cells transfected with PIZ-OpIE2-GST-EGFP, PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed and PIZ-OpIE2-GST-DsRed-BmGcm plasmids。標尺Scale bar=5 μm

2.8 Bmgcm過表達及對周期的影響

對PIZ-OpIE2-GST-DsRed和PIZ-OpIE2-BmGcm- GST-DsRed質粒進行改裝，去除了GST-DsRed表達元件（圖7-A）。Western blot結果表明PIZ-gcm質粒能夠在家蠶BmE-SWU3細胞中顯著上調Bmgcm蛋白的表達水平（圖7-B）。隨后，利用EDU細胞增殖標記對細胞的增殖情況進行研究，結果顯示過表達組的細胞增殖要低于空載組（圖7-C），且差異顯著（＜0.05）（圖7-D）。同時利用流式細胞儀對細胞周期進行分析，結果顯示過表達組細胞G1期細胞比例增高，且差異顯著（＜0.05），而S期細胞比例顯著降低（圖7-E、7-F）。同時，利用實時熒光定量PCR技術，對過表達前后周期相關調控因子進行檢測。如圖7-G所示，與對照組相比，過表達組除外，、、和均廣泛下調。

3 討論

Gcm作為一類重要的轉錄因子，在果蠅神經[23,27-28]和血細胞[3,29]發育中發揮著重要的調控功能。在哺乳動物（人和小鼠）以及果蠅等多種物種中均鑒定得到gcm的同源蛋白，這類蛋白在N端均有一段非常保守的GCM motif基序，能夠特異性識別DNA上的(A/G)CCCGCAT序列[30]，進而調控基因的表達。為了揭示gcm在家蠶中的功能，通過檢索家蠶基因組數據庫，對進行鑒定和全長克隆。與其他物種gcm蛋白結構相似，BmGcm蛋白在N端也有一個保守的GCM motif，表明BmGcm與已報道的同源蛋白具有相似或相同的DNA結合模式，比對結果表明BmGcm蛋白與其他同源蛋白在GCM motif區域具有較高的保守性。

A：載體構建策略 The strategy for constructing vector；B：Western blot檢測過表達細胞中Bmgcm蛋白的表達 Expression of Bmgcm protein in the transfected cells detected by western blot；C：EDU檢測細胞增殖情況 The proliferate rates of transfected cells detected by EDU staining assay；D：轉染細胞增殖率統計 Quantification of transfected cells positive for EDU staining；E：流式分析轉染細胞周期（碘化丙啶染色） The cell cycle of transfected cells analyzed by flow cytometry (staining with pyridine iodide)；F：流式分析轉染細胞周期結果統計分析 Statistical analysis of the results from flow cytometry assay；G：周期相關基因定量檢測Quantitative detection of the genes related to cell cycle。*：p＜0.05；**：p＜0.01

在胚胎第4天表達達到峰值，隨后表達水平逐漸降低，暗示在家蠶胚胎發育中發揮著重要的功能。檢測在幼蟲各組織的表達情況，發現該基因主要表達于中腸、精巢和卵巢，而在脂肪體有微弱的表達，暗示在這些組織中可能也發揮一定的功能。

核蛋白的結構與功能研究中，核定位機制的確定是一項重要的研究內容。在真核細胞內，蛋白質入核必須通過核孔復合體才能進入細胞核。分子量較小的蛋白可以自由穿過或通過被動擴散進入細胞核，而分子量較大的蛋白則需要與核輸入蛋白互作才能入核[25]。為了排除被動運輸的干擾，在載體中添加了GST表達元件，這樣表達的GST-DsRed融合蛋白就只能定位于胞質中，這也是許多學者在進行亞細胞定位分析，特別是轉錄因子核定位信號分析時的一種常用策略[31-32]。圖6顯示GST-DsRed融合蛋白只分布于細胞質中，在細胞核沒有信號，說明該策略是有效的。此外，為了增加結果的可靠性，BmGcm蛋白與GST-DsRed融合標簽采取了兩種不同的融合方式，即BmGcm-GST-DsRed和GST-DsRed-BmGcm。BmGcm熒光信號聚集于細胞核，這進一步證實BmGcm也具有轉錄因子的功能。

為了進一步探索的功能，在家蠶BmE- SWU3細胞系上過表達。Western blot結果顯示與對照組相比，過表達組靶標蛋白的表達水平明顯增高，意味著在細胞系水平成功過表達。本研究中，過表達會明顯抑制細胞的增殖，進一步分析發現試驗組的細胞周期進程明顯受到影響，G1期細胞比例增高，而S期細胞比例降低。定量結果顯示G1/S期細胞周期監檢測點關鍵調控蛋白大部分出現了顯著的下調。推測可能通過調控這些周期相關蛋白，將細胞周期阻滯于G1期，從而抑制細胞的增殖。

4 結論

從家蠶基因組中克隆得到，該基因定位于4號染色體。在胚胎發育第4天表達達到峰值，而在幼蟲階段，主要表達于中腸、精巢和卵巢。構建原核表達載體，在大腸桿菌中成功誘導表達，經純化獲得重組蛋白后免疫小鼠，成功制備了可特異識別重組蛋白的抗體。BmGcm蛋白定位于細胞核，細胞實驗發現可以顯著抑制增殖和影響正常的細胞周期進程。

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（責任編輯 岳梅）

Identification, expression, subcelluar localization, and function of() in silkworm ()

ZHANG Kui, PAN Guangzhao, SU Jingjing, TAN Juan, XU Man, LI Yutian, CUI Hongjuan

(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716)

【】The objective of this study is to identify and clone(), analyze its expression and subcelluar localization, prepare polyclonal antibody and overexpressat the cellular level to explore its function in proliferation and cell cycle, and to provide a theoretical basis for further studying the function of Bmgcm in.【】The full-length ofwas acquired by RACE technology. Basic sequence and structural information ofwere analyzed by using several online softwares, including ORF Finder and SMART. Multiple sequence alignment and evolutionary analysis were acquired by Clustalx and MEGA 6.0, respectively. The expression profile was investigated by RT-PCR and real-time PCR. The recombinant protein of Bmgcm was obtained using prokaryotic expression system, and purified with nickel affinity chromatography, then the antibody was prepared. Bmgcm over-expression vector was transfected intocell line to analyze the subcellular location of Bmgcm, and EDU and flow cytometry were used to study its function. 【】The(BGIBMGA006182) was clustered on nscaf2847 which was located on chromosome 4. The genomic DNA total length ofis 4 046 bp, which contains 4 exons and 3 introns. The full-length of cDNA is 1 734 bp, with a 166 bp 5′ UTR, a 227 bp 3′ UTR and a 1 341 bp open reading frame (ORF). This gene encodes 446 amino acid residues, the predicted molecular mass is 50.61 kD and the pI is 5.557, which contains a typical GCM-motif. Multiple sequence alignment demonstrated that GCM motif was highly conserved. Phylogenetic analysis revealed that gcm of insect was clustered alone, and Bmgcmhad thehighest relationship withgcm from. The expression profile revealed thatreached peak at the 4th day of embryonic period, and then gradually decreased during embryonic stage.mainly expressed in larval midgut, testis and ovary. The complete ORF sequence of Bmgcm was inserted into prokaryotic expression system, and the recombinant protein of Bmgcm was induced by IPTG and purified using affinity chromatography. Finally, mice were immunized with purified proteins to produce polyclonal anti-gcm antibody. Western blot results indicated that the antibody could specifically recognize the target protein. Moreover, Bmgcm was overexpressed incell line, and the result suggested that Bmgcm was located in nucleus. Furthermore,could inhibit cell proliferation and arrested cell cycle in G1/S period. 【】Thewas identified and cloned, its expression profile and subcelluar localization were analyzed. The available polyclonal antibody was generated by prokaryotic expression, affinity chromatography, and animal immunization. Overexpressedcould inhibit cell proliferation and affect cell cycle progression.

(); cloning; expression analysis; antibody preparation; overexpression

2017-08-13；

2017-11-10

國家自然科學基金（31672496）、中國博士后科學基金（2017M620408）、重慶市自然科學基金（cstc2016jcyjA0425）、重慶市高校創新團隊建設計劃（CXTDX201601010）

張奎，Tel：023-68251712；E-mail：Zhangk87@gmail.com，Zhangk87@163.com。

崔紅娟，Tel：023-68251713；E-mail：Hongjuan. cui@gmail.com，hcui@swu.edu.cn