醉馬芨芨草生物堿薄層色譜分析及GC-MS檢測

張睿涵 ， 李國中 ， 孫 暾 ， 達能太 ， 王建國 ， 路 浩 ， 趙寶玉

(1.西北農林科技大學動物醫學院 ， 陜西 楊凌 712100 ； 2.內蒙古阿拉善左旗獸醫站 ， 內蒙古 阿拉善 750300)

對于醉馬芨芨草毒性成分的研究可追溯至20世紀，最開始人們認為中毒原因是其芒刺刺入動物皮膚、口腔、扁桃體等處引起物理性刺傷所致，現大量研究表明，其毒性成分是共生于植物中的內生真菌產生的生物堿[1-2]，主要是麥角新堿和麥角酰胺。但是否還含有其他類型生物堿，醉馬芨芨草生物堿成分系統分析及毒性作用機制有待深入研究。

本試驗采用生物堿提取方法結合薄層色譜和GC-MS法分析醉馬芨芨草中所含有的生物堿數量及種類。以采自內蒙古阿拉善天然草地的醉馬芨芨草為材料通過醉馬芨芨草總浸膏的提取、生物堿定性檢驗、分段萃取、薄層色譜分析證明醉馬芨芨草中存在生物堿及其所在溶劑部位、種類數。為避免雜質太多導致的GC-MS法檢測結果的不準確，需先將所得浸膏使用柱硅膠層析法除雜后使用GC-MS法進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 植物材料 醉馬芨芨草全草與2014年8月采集于內蒙古阿拉善盟左旗(38°49′58.76″N，105°39′43.76″E)，曬干，粉碎備用。植物標本由西北農林科技大學生命科學學院常朝陽研究員鑒定。

1.2 主要儀器與試劑 MC浙制02810218XMTB數顯控溫水浴鍋，北京市長風儀表公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠； Canoscan LiDE 30彩色圖像掃描儀，佳能公司；UV-III 三用紫外分析儀，北京炳洋科技有限公司； SHB-III循環式多用真空泵，鄭州長城科貿有限公司；HP6890/5975C GC-MS聯用儀，美國安捷倫公司；硅膠GF254，青島海洋化工廠；改良碘化鉍鉀顯色機現用現配，其他試劑均為分析純。

1.3 醉馬芨芨草生物堿的提取 本試驗采用工業酒精冷浸法和工業酒精熱回流法兩種方法提取。工業酒精冷浸法，稱取醉馬芨芨草干粉5 kg置于25 L塑料桶中，倒入工業酒精沒過草粉。1周更換1次工業酒精并減壓回收，兩月后將所得浸膏合并，計算出膏率。工業酒精熱回流法，取醉馬芨芨草干粉1.2 kg，分3批，每批400 g平均分裝于4個1 000 mL圓底燒瓶中加適量工業酒精于60 ℃條件下熱回流提取，每次熱回流4 h，連續進行直至提取液澄清無色為止。提取完畢后將各批次提取液分別減壓回收，將所得浸膏合并后計算出膏率。

根據生物堿的溶解性和極性依次采用酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇對工業酒精提取部分進行分段萃取。每次萃取完后，減壓回收溶劑得各部分浸膏，計算出各萃取段出膏率。

1.4 薄層色譜分析 使用自制薄層板取上述各浸膏無水乙醇溶解液，用毛細管吸取適量液體，點于距薄層板底邊約0.5 cm的起始線上，點與點之間距離保持在0.5～1 cm，樣點直徑小于2 mm，各樣點位于同一水平位置。經反復試驗后選取適宜展開劑，放入展開槽中上行法展開，展開前沿距玻璃板上端1 cm時取出用電吹風機吹干，使用改良碘化鉍鉀顯色。

1.5 硅膠柱層析法除雜純化 將各萃取段按質量比1∶1與柱層析硅膠充分拌勻，用氯仿濕法裝柱，干法上樣，后依次使用氯仿、氯仿∶甲醇(50∶1)、氯仿∶甲醇(20∶1)、氯仿∶甲醇(10∶1)、氯仿∶甲醇(5∶1)、氯仿∶甲醇(3∶1)、氯仿∶甲醇(1∶1)、甲醇為洗脫劑進行洗脫，每10 mL收集一瓶，將每瓶樣品使用薄層色譜法檢測，并合并Rf值相同或相近的組份。

1.6 GC-MS法分析 將純化后的樣品用甲醇溶解，用GC-MS儀器檢測生物堿的種類和相對含量。氣象色譜條件：色譜柱為 ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫 50 ℃(保留 2 min)，以 5 ℃ /min升溫至 310 ℃，保持10 min；運行時間：64 min；汽化室溫度 250 ℃；載氣為高純 He(99.999%)；柱前壓7.65 psi，載氣流量 1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時間：3.0 min。質譜條件：離子源為 EI 源；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度 150 ℃；電子能量 70 eV；發射電流 34.6 μA；倍增器電壓 1294 V；接口溫度 280 ℃；質量范圍 29～500 amu。

2 結果

2.1 生物堿提取結果 使用工業酒精冷浸法提取醉馬芨芨草生物堿的浸膏含量為293.21 g，出膏率為5.8%，使用工業酒精熱回流法提取的浸膏含量為120.10 g，出膏率為10.01%，約為冷浸法的兩倍。其中工業酒精冷浸法提取酸性氯仿段浸膏重量為2.8 g，出膏率為1.16%；堿性氯仿段浸膏重量為0.24 g，出膏率為0.1%；堿性正丁醇段浸膏重量為14.97 g，出膏率為6.23%，工業酒精熱回流法提取酸性氯仿段浸膏重量為0.83 g，出膏率為0.69%；堿性氯仿段浸膏重量為0.25 g，出膏率為0.21%；堿性正丁醇段浸膏重量為18.71 g，出膏率為15.58%。

2.2 各萃取段薄層色譜分析結果 醉馬芨芨草工業酒精提取部分酸性氯仿萃取段，共使用了27種展開系統進行展開，其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=11∶1∶1展開效果最好，在改良碘化鉍鉀顯色條件下有3個斑點；堿性氯仿萃取段，共使用了29種展開系統進行展開，其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=7∶1∶1展開效果最好，在改良碘化鉍鉀顯色條件下有4個斑點；堿性正丁醇萃取段，共使用了24種展開系統進行展開，其中V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1展開效果最好，在改良碘化鉍鉀顯色條件下有2個斑點。結果見表1。

表1 醉馬芨芨草生物堿薄層色譜分析結果

2.3 醉馬芨芨草各萃取段柱層析結果 酸性氯仿段共回收164份樣品，經薄層色譜法分析合并為3份待測樣品，分別是4-14、15-104、105-164，命名為酸性氯仿1、酸性氯仿2和酸性氯仿3；堿性氯仿段共回收246份樣品，經薄層色譜法分析合并為3份待測樣品，分別是66-123、132-182、183-246，命名為堿性氯仿1、堿性氯仿2、堿性氯仿3；堿性正丁醇段共回收155瓶樣品，經薄層色譜法分析合并為2瓶待測樣品，分別是5-111、112-155，命名為堿性正丁醇1、堿性正丁醇2。

2.4 醉馬芨芨草生物堿GC-MS法分析結果 將上述8份樣品使用GC-MS法分析鑒定，其中酸性氯仿1、酸性氯仿3和堿性氯仿3檢測出生物堿。經質譜計算機數據系統檢索及核對 Nist2008和 Wiley275 標準質譜圖，酸性氯仿1共出峰63個，檢出13個化合物，其中有2種生物堿，分別是甲基乙基馬來酰亞胺和乙琥胺(圖1、表2)；酸性氯仿2共出峰35個，檢出12個化合物，其中有2種生物堿，分別是三丙酮胺和芥酸酰胺(圖2、表3)；堿性氯仿共出峰29個，檢出10個化合物，其中有2種生物堿，分別是槐定堿和芥酸酰胺(圖3、表4)。

圖1 醉馬芨芨草酸性氯仿1 GC-MS總離子流圖

表2 酸性氯仿1 GC-MS法檢測結果

圖2 醉馬芨芨草酸性氯仿3 GC-MS總離子流圖

圖3 醉馬芨芨草堿性氯仿3GC-MS總離子流圖

表3 酸性氯仿3 GC-MS法檢測結果

3 討論

從醉馬芨芨草生物堿提取方法結果來看，工業酒精熱回流法的出膏率是冷浸法的出膏率兩倍還多，從薄層色譜結果來看，生物堿顯色基本沒有差別，所以對于醉馬芨芨草生物堿的提取，工業酒精熱回流法效率更高效果更好。

表4 堿性氯仿3GC-MS法檢測結果

1992年黨曉鵬等[3]從采自寧夏海原南華山醉馬芨芨草中分離出生物堿二氯化六甲基乙二銨，經動物毒性試驗證明是醉馬芨芨草的主要有毒成分，并命名為醉馬草毒素；1992年汪恩強等[4]人工合成二氯化六甲基乙二銨，給馬按1 000 mg/kg體重劑量口服，未復制出中毒病例。

醉馬芨芨草為禾本科植物，組織中存在多種內生真菌，這些內生真菌與宿主互利共生，可提高宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力，包括抗病性[5]、抗寒性[6]、抑菌性[7]、耐重金屬性[8]等。且這些內生真菌絕大多數可以在宿主植株體內產生生物堿，這些生物堿可能與引起家畜中毒有關。

1998年李學森等[9]在與新西蘭研究機構的合作中發現，醉馬芨芨草中含有多種生物堿且多為麥角類生物堿，其中含量最高的是麥角新堿和麥角酰胺，認為是其主要毒性物質。而早在1982年，張友杰等[10]就從采自新疆昌吉醉馬芨芨草中分離出麥角新堿和異麥角新堿。而二者使用的醉馬芨芨草樣本都采集自新疆昌吉地區，而后蘭州大學的李春杰等從采自甘肅夏河的醉馬芨芨草種子培育出的植株中也檢測出了麥角類生物堿。2006年桑明[11]從采自甘肅天祝的醉馬芨芨草中分離出的7種生物堿，卻并未檢測出麥角類生物堿。根據本試驗GC-MS法分析結果，從采自內蒙古阿拉善的醉馬芨芨草中共檢測出5種生物堿，其中含量最高的是存在于堿性氯仿段的槐定堿(sophoridine)，與桑明分離出的生物堿無一一致，也未檢出文獻中報道的麥角類生物堿麥角新堿和麥角酰胺。這也許與醉馬芨芨草生長環境、生物堿提取方式有關。

據藥典介紹，麥角新堿是一種極性很大的化合物，但在本試驗正丁醇段并未檢出生物堿，并且在該段有幾種含量很高的化合物也未檢出(保留時間：16.9，相對含量57.808%、保留時間：31.858，相對含量：24.483%)，可能與質譜數據庫大小有關。代樂英等[12]研究表明，帶內生真菌的醉馬芨芨草植株均能檢測到不同含量的麥角生物堿，而不帶內生真菌的植株均未能檢測出這兩種生物堿。故在本試驗中檢測出的5種生物堿究竟是內生真菌產生的還是植株自身產生，內生真菌是否會選擇性的產生生物堿還有待研究。至于這批從內蒙古阿拉善采集的醉馬芨芨草的毒性大小，也有待進一步試驗驗證。

參考文獻：

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[2] 梁瑩．醉馬草內生真菌共生體對小尾寒羊的影響[D]．蘭州：蘭州大學，2011．

[3] 黨曉鵬，曹光榮，段得賢，等．醉馬草的有毒成分研究[J]．畜牧獸醫學報，1992，4(23)：366-371．

[4] 汪恩強．醉馬草有毒成分：二氯化六甲基乙二銨的合成和毒理研究[D]．楊凌：西北農業大學，1992．

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[6] Chen N, He R, Chai Q,etal. Transcriptomic analyses giving insights into molecular regulation mechanisms involved in cold tolerance by epichloё endophyte in seed germination of achnatherum inebrians[J]. Plant Growth Regulation, 2016，1-9.

[7] 孫一丹, 張興旭, 古麗君,等.醉馬草-內生真菌共生體中生物堿的抑菌活性[J]. 草業科學, 2015，32(4): 508-514.

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[9] 李學森，張學洲，顧祥，等．醉馬草有毒物質與其內生真菌的關系[J]．草食家畜，1998(4)：44-46．

[10] 張友杰，朱子清．醉馬草化學成分的研究[J]．高等學校化學學報，1982(3)：150-151．

[11] 桑明，張繼，姚健，等．醉馬草毒性成分的分析研究[J]．畜禽業，2006(12)：9-11．

[12] 代樂英，黃璽，李春杰，等．麥角生物堿在醉馬草內生真菌共生體中的空間分布[J]．草業學報，2010，19(6)：215-221．