大豆抗原蛋白對仔豬的免疫作用

張　瑜，王元紅，湯雪冰，彭成璐，舒迎霜，曹程鳴，馮士彬，李　玉，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

大豆作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源，一直被廣泛應(yīng)用于畜禽飼糧。然而大豆及其制品中存在的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如大豆凝集素、大豆抗原蛋白、胰酶抑制因子等，會影響動物機(jī)體對營養(yǎng)成分的吸收。這些抗?fàn)I養(yǎng)因子使得幼畜出現(xiàn)腸道過敏反應(yīng)，導(dǎo)致腸道形態(tài)損傷、免疫功能紊亂、生長抑制和腹瀉，甚至死亡等[1-4]。

研究表明，大豆抗原蛋白是大豆中的主要致敏因子。依據(jù)蛋白質(zhì)沉降系數(shù)，可將大豆抗原蛋白分為2S、7S、11S等，其中β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)是主要致敏原[5]。業(yè)已證實(shí)，豆粕發(fā)酵和大豆膨化等多種方法能降低大豆制品的抗原活性，但因大豆抗原蛋白熱穩(wěn)定性高，目前市面上的方法依然不能使之充分滅活[6]。為了使大豆及其制品能更充分、安全、有效地得到利用，降低或消除其致敏性，國內(nèi)外研究人員對其免疫原性和致敏原性進(jìn)行了很多研究：一方面，使用物理、化學(xué)、遺傳育種等技術(shù)，尋找降低或者消除大豆抗原蛋白的方法[7-8]；另一方面，研究者從大豆抗原蛋白對動物機(jī)體的生產(chǎn)性能、免疫功能、腸道功能的影響入手[9]，深入探索大豆抗原蛋白對動物機(jī)體的致敏機(jī)理。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用純化的7S及11S制備成免疫劑，采用口服及注射兩種免疫方法深入探索大豆抗原蛋白的致敏原性與免疫原性，通過檢測仔豬血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平和抗體效價(jià)及皮膚致敏反應(yīng)，研究大豆抗原蛋白對仔豬的免疫效果及作用機(jī)制，以期為大豆及其產(chǎn)品的安全使用提供新的途徑。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料與試驗(yàn)動物

大豆抗原蛋白7S和11S由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院提供，再次純化后7S純度為92.3%、11S純度為93.1%?！岸拧灵L×大”三元雜交仔豬，由安徽省青陽縣五星養(yǎng)殖有限公司提供。冷凍高速離心機(jī)購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2　大豆抗原蛋白免疫劑的制備和檢測

佐劑的準(zhǔn)備。弗氏佐劑，包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑。

乳化抗原蛋白。在1.5 mL的EP管中，加入0.5 mL的11S抗原液或7S抗原液和0.5 mL的佐劑(第一次免疫劑用弗氏完全佐劑，第二次免疫劑用弗氏不完全佐劑)，先用渦旋機(jī)混勻，再進(jìn)行超聲混勻。乳化后取一滴在清水里，觀察是否分散，不分散即乳化完全，分散則繼續(xù)乳化。乳化完成后，4 ℃冷藏保存。制備的11S免疫劑或7S免疫劑，經(jīng)培養(yǎng)基無菌檢驗(yàn)和肌肉注射刺激家兔腿部肌肉證明安全且無刺激反應(yīng)。

1.3　試驗(yàn)分組

本試驗(yàn)采用隨機(jī)分組設(shè)計(jì)：對照組(A組)，7S致敏組(B組)，11S致敏組(C組)，7S口服免疫+致敏組(D組)，11S口服免疫+致敏組(E組)，7S注射免疫+致敏組(F組)，11S注射免疫+致敏組(G組)。選取70頭7日齡體重相近、健康狀況良好的“杜×長×大”三元雜交仔豬進(jìn)行試驗(yàn)，分成7組，每組10頭。仔豬在7日齡時(shí)，A組注射生理鹽水，D、F組和E、G組按分組設(shè)計(jì)以1 mg·kg-1體重的劑量口服或注射純化的7S免疫劑或11S免疫劑，在14日齡時(shí)，按以上方法再免疫一次。在27日齡時(shí)，對仔豬進(jìn)行皮膚致敏試驗(yàn)。所有仔豬于21日齡斷奶。從21日齡開始，對照組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧(仔豬代乳料，不含大豆或大豆制品)，B、D、F組和C、E、G組仔豬分別飼喂添加5%的7S或11S的基礎(chǔ)日糧，連續(xù)飼喂7 d。分別在7、14、21和27日齡，每天上午7:00—8:00，仔豬前腔靜脈采血，樣品于室溫靜置2～3 h，600g離心10 min，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)仔豬采用全封閉飼養(yǎng)管理，自由飲水和采食，消毒免疫程序均按照豬場管理常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。從7日齡開始，對全部試驗(yàn)仔豬飼喂仔豬代乳料，直至21日齡。

1.5　大豆抗原蛋白的皮膚致敏試驗(yàn)

在27日齡時(shí)，每組隨機(jī)選擇4頭仔豬，麻醉后，確定無針刺反應(yīng)，用記號筆在仔豬腹部剃毛皮膚上劃分出3個(gè)皮試區(qū)域，分別在相應(yīng)區(qū)域皮內(nèi)注射生理鹽水或濃度為5 mg·mL-1的11S或7S蛋白溶液0.1 mL，30 min后，觀察并記錄皮膚反應(yīng)情況。根據(jù)紅斑直徑大小來判斷：1級，未見紅斑，記為“-”；2級，紅斑直徑1～5 mm，記為“±”；3級，紅斑直徑5～10 mm，記為“+”；4級，紅斑直徑10～20 mm，記為“++”；5級，紅斑直徑>20 mm，記為“+++”。

1.6　瓊脂擴(kuò)散法測定抗體效價(jià)

取7、14、21、27日齡仔豬的血清，以純化后的7S和11S作為抗原，使用打孔器，在1%瓊脂平板的中央打一個(gè)孔，圍繞中央再打6個(gè)孔，在中間孔內(nèi)加入純化的7S或11S，濃度為1 mg·mL-1，周圍的6個(gè)孔分別加入1∶1、1∶2、1∶4、1∶16、1∶32、1∶64的抗血清，滴滿不溢出即可，37 ℃的溫箱中孵育24 h。當(dāng)抗原抗體濃度之比相適宜時(shí)，能形成一白色弧狀沉淀線，然后觀察沉淀線，確定抗體效價(jià)。

1.7　仔豬血清樣品采集與血清中IgA、IgM、IgE、IgG和 IL-4水平的測定

取7、14、21、27日齡仔豬的血清，按照ELISA試劑盒說明書中的方法測定血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平。

1.8　數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用SPSS軟件中的ANOVA過程對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對有顯著差異的處理采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1　大豆抗原蛋白免疫劑安全性檢測結(jié)果

大豆抗原蛋白免疫劑接種培養(yǎng)基無細(xì)菌生長，注射家兔肌肉無充血現(xiàn)象，說明11S免疫劑和7S免疫劑有較高安全性。

2.2　大豆抗原蛋白皮膚致敏試驗(yàn)

皮膚致敏30 min后，所有仔豬皮膚生理鹽水注射點(diǎn)的結(jié)果基本顯示“-”，A組7S和11S蛋白注射點(diǎn)的結(jié)果也基本上顯示為“-”，即致敏反應(yīng)不明顯，B、C組基本在“+”級以上，且7S蛋白注射點(diǎn)的評判結(jié)果達(dá)到了“++”級以上，表示仔豬出現(xiàn)過敏反應(yīng)，D、E組基本為“++”級以下，F(xiàn)、G組基本為“+”級以下(表1)。以上結(jié)果說明，免疫后再致敏能對仔豬產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

表1大豆抗原蛋白對仔豬皮膚過敏分級計(jì)數(shù)結(jié)果

Table1Results of skin test reactions in piglets induced by soybean antigen protein

注射試劑Injectionreagent組別Group-±++++++生理鹽水A組 GroupA40000PhysiologicalB組 GroupB31000salineC組 GroupC40000D組 GroupD40000E組 GroupE31000F組 GroupF40000G組 GroupG310007SA組 GroupA31000B組 GroupB00013D組 GroupD00130F組 GroupF0130011SA組 GroupA31000C組 GroupC00022E組 GroupE00220G組 GroupG01300

2.3　瓊脂擴(kuò)散法檢測抗體效價(jià)

由表2可以看出，在21日齡，F(xiàn)、G組仔豬血清中抗體效價(jià)達(dá)1∶32，D、E組達(dá)1∶16。在27日齡時(shí)，B、C組仔豬血清中抗體效價(jià)水平高達(dá)1∶64，而D、E、F、G組為1∶32，說明11S和7S可以使仔豬發(fā)生致敏反應(yīng)和免疫作用，血清中存在可檢測的特異性大豆蛋白的抗體。

2.4　大豆抗原蛋白對仔豬血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平的影響

2.4.1仔豬血清中IgA水平的變化

如表3所示，在7日齡、14日齡和21日齡時(shí)，各組仔豬體內(nèi)血清IgA的水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。在27日齡時(shí)，B、C、D、E組顯著(P<0.05)高于A、F、G組。

表2β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白對仔豬血清中抗體效價(jià)的影響

Table2Effects of β-conglycinin and glycinin on serum antibody titers in piglets

組別Group7日齡7daysold14日齡14daysold21日齡21daysold27日齡27daysoldA組GroupA————B組GroupB———1∶64C組GroupC———1∶64D組GroupD—1∶41∶161∶32E組GroupE—1∶41∶161∶32F組GroupF—1∶161∶321∶32G組GroupG—1∶161∶321∶32

表3β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白對仔豬血清IgA水平的影響

Table3Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgA levels in piglets

mg·mL-1

同列各處理間無相同大、小寫字母的分別表示差異極顯著(P<0.01)與顯著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same uppercase or lowercase letters within the same column indicated significant difference atP<0.01 orP<0.05， respectively. The same as below.

2.4.2仔豬血清中IgM水平的變化

如表4所示，在仔豬7日齡和14日齡時(shí)，各組IgM水平?jīng)]有顯著差別(P>0.05)。在21日齡時(shí)，D、E、F、G組IgM水平與A、B、C組相比顯著(P<0.05)升高，且F、G組IgM水平顯著(P<0.05)高于D、E組。在27日齡時(shí)，各處理組IgM水平與A組相比均顯著(P<0.05)增加，且B、C組IgM水平顯著(P<0.05)高于D、E、F、G組。隨時(shí)間推移，各組IgM水平整體呈現(xiàn)下降趨勢。

2.4.3仔豬血清中IgE水平的變化

如表5所示，在7、14日齡時(shí)，各組仔豬體內(nèi)血清IgE的水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。在21日齡時(shí)，D、E、F、G組仔豬體內(nèi)血清IgE的水平極顯著(P<0.01)高于A、B、C組，F(xiàn)、G組顯著(P<0.05)高于D、E組。在27日齡時(shí)，各處理組仔豬體內(nèi)血清IgE的水平與A組相比均極顯著(P<0.01)升高，其中，B組顯著(P<0.05)高于C組，B、C組極顯著(P<0.01)高于D、E、F、G組，D、E組與F、G組相比顯著(P<0.05)升高。

2.4.4仔豬血清中IgG水平的變化

如表6所示，在仔豬7日齡時(shí)，各組IgG水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。在14、21日齡時(shí)，F(xiàn)組與其他組相比IgG水平顯著(P<0.05)增加。

表4β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白對仔豬血清IgM水平的影響

Table4Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgM levels in piglets

mg·mL-1

表5β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白對仔豬血清IgE水平的影響

Table5Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgE levels in piglets

mg·mL-1

表6β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白對仔豬血清IgG水平的影響

Table6Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgG levels in piglets

mg·mL-1

在27日齡時(shí)，與A組相比，其余各組IgG水平極顯著(P<0.01)增加，B、C組顯著(P<0.05)高于D、E、F、G組，D、E組又顯著(P<0.05)高于F、G組，B組顯著(P<0.05)高于C組。

2.4.5大豆抗原蛋白對仔豬血清中IL-4水平的影響

由表7可知，在仔豬7日齡時(shí)，各組IL-4水平?jīng)]有明顯差異(P>0.05)。在14日齡時(shí)，F(xiàn)、G組IL-4水平顯著(P<0.05)高于其他各組。在21日齡時(shí)，D、E、F、G組IL-4水平極顯著(P<0.01)高于其他組，F(xiàn)、G組顯著(P<0.05)高于D、E組。在27日齡時(shí)，F(xiàn)、G組IL-4水平顯著(P<0.05)高于A組，B、C組和D、E組極顯著(P<0.01)高于A組，F(xiàn)、G組極顯著(P<0.01)低于D、E組，B組顯著(P<0.05)高于C組，D、E組與B組相比顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)、G組與B、C組相比極顯著(P<0.01)降低。

表7β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白對仔豬血清IL-4水平的影響

Table7Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IL-4 levels in piglets

mg·mL-1

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，大豆抗原蛋白致敏仔豬能顯著提高血清中IgG、IgA、IgM、IgE，以及IL-4水平，且7S的致敏性高于11S。大豆抗原蛋白免疫劑對仔豬具有一定的免疫保護(hù)作用，其中，7S的免疫效果優(yōu)于11S，注射免疫的效果優(yōu)于相同劑量的口服免疫。

大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白具有免疫原性，是引起動物腸道發(fā)生過敏反應(yīng)的主要成分[2]。在本試驗(yàn)中，對照組的11S蛋白注射點(diǎn)、7S蛋白注射點(diǎn)的紅斑直徑大小與生理鹽水注射點(diǎn)相似，說明不致敏的仔豬注射少量的11S和7S并不會引起仔豬發(fā)生過敏反應(yīng)。而致敏組的評判結(jié)果均在“+”級或“+”級以上，其中，7S致敏組評判結(jié)果達(dá)到“++”級以上，說明7S的免疫原性比11S更強(qiáng)，這與Chen等[10]和徐述亮等[11]的結(jié)果一致。免疫致敏組相較于致敏組反應(yīng)較輕，說明免疫后再致敏會降低過敏反應(yīng)，有一定的免疫保護(hù)作用，這在抗體效價(jià)和血清學(xué)檢測中也得到了證實(shí)。注射致敏組的反應(yīng)輕于口服致敏組，這可能是因?yàn)橥ㄟ^注射途徑進(jìn)行免疫，可很快地被吸收循環(huán)到全身。而大豆抗原蛋白作為大分子物質(zhì)，經(jīng)口服途徑免疫，不易被完整吸收，一些被酶消化分解后吸收，一些被排出體外，不能有效地發(fā)揮免疫保護(hù)作用。

研究表明，大豆抗原蛋白引起的過敏反應(yīng)是多種免疫機(jī)制共同作用的結(jié)果。7S和11S進(jìn)入機(jī)體后，主要引起由IgE介導(dǎo)的I型過敏反應(yīng)、免疫復(fù)合物介導(dǎo)的Ⅲ型過敏反應(yīng)，以及T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的IV型遲發(fā)性過敏反應(yīng)[12-14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在仔豬27日齡時(shí)，大豆抗原蛋白處理組IgG和IgE的抗體水平均有明顯升高，且7S致敏組高于11S致敏組，說明IgG和IgE參與了過敏反應(yīng)，且7S的免疫原性要高于11S，這與Wu等[15]、曹程鳴等[16]、Sun等[17]的研究結(jié)果相似。另外，Guo等[18]建立的以大鼠為試驗(yàn)動物的過敏反應(yīng)模型也發(fā)現(xiàn)，血清中的IgE水平顯著升高。經(jīng)過免疫后再致敏的仔豬，其IgG的抗體水平明顯低于致敏組，且注射致敏組要低于口服致敏組。這說明提前免疫能增強(qiáng)動物機(jī)體體液免疫能力，且注射免疫的效果明顯要優(yōu)于口服免疫。仔豬免疫后，體內(nèi)IgA抗體水平?jīng)]有明顯差別，但致敏后IgA的抗體水平顯著提高，IgM的抗體水平較對照組有明顯上升，隨著日齡的增加，整體呈現(xiàn)下降趨勢。究其原因，可能是雖然初次應(yīng)答產(chǎn)生的最早的抗體是IgM，且在幾天內(nèi)達(dá)到高峰，但隨后便會快速下降，當(dāng)機(jī)體再次應(yīng)答時(shí)，會產(chǎn)生大量的IgG，從而減少了IgM 的分泌。

細(xì)胞因子在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[8]。Lallès等[19]研究發(fā)現(xiàn)，給犢牛飼喂添加大豆抗原蛋白的日糧，能導(dǎo)致腸道損傷，Th2細(xì)胞可以分泌IL-4和IL-6等細(xì)胞因子，參與Ⅰ型過敏反應(yīng)與炎癥反應(yīng)。李寶等[20]通過在日糧中添加不同劑量的7S和11S飼喂仔豬也得到了相似的結(jié)果，推測IL-4在I型過敏反應(yīng)中起了重要作用。本試驗(yàn)中，口服或注射大豆抗原蛋白免疫劑，均可使仔豬血清中IL-4水平明顯升高。致敏組仔豬與對照組相比，血清中IL-4的水平有極顯著差異，與免疫后致敏組相比有顯著差異，且7S組較11S組差異顯著。此外，一些研究表明，IL-4對很多細(xì)胞都具有免疫調(diào)節(jié)作用。IL-4能增強(qiáng)B細(xì)胞的抗原提呈能力，小量的抗原刺激即會激發(fā)免疫應(yīng)答。IL-4也能增強(qiáng) IgG1和IgE水平，甚至可以與IL-3協(xié)同，刺激黏膜的肥大細(xì)胞生長[17，21]。這說明，IL-4在速發(fā)型過敏反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，是炎癥和免疫防御的主要參與者。

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