11種荊芥種質資源ISSR分析

王向東，馬艷芝，客紹英

(1.唐山市農業科學研究院，河北 唐山 063001； 2.唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000)

荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)為唇形科草本植物荊芥的干燥地上部分，始載于《吳普本草》[1]。荊芥主治感冒頭痛、風疹、咽喉腫痛等病癥，為中醫臨床上的常用藥物[2-3]?，F代荊芥以人工栽培為主，主要分布在江蘇、浙江、河北、東北三省等地，其中河北安國荊芥和浙江蕭山荊芥最為有名[4]。前人對荊芥的研究主要在栽培方法、炮制加工、化學成分、藥理作用和臨床應用等方面，如有學者對荊芥的高產栽培技術[5]、大田栽培技術[6]、規范化生產栽培技術[7]等進行過研究。周麗娜[8]對荊芥的化學成分就藥理作用進行了研究，結果表明，荊芥具有抗病毒、抗氧化等藥理作用。何婷等[9]發現，荊芥揮發油、薄荷酮和胡薄荷酮治療方式給藥，顯示出體內抗病毒作用。還有學者發現，荊芥穗可應用于蕁麻疹、水痘、流行性腮腺炎、鼻竇炎等[10]。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記技術是利用PCR擴增進行檢測的DNA分子標記[11]。該標記技術具有模板需求量少、多態性豐富、操作簡單、重復性好、信息量大等優點[12]，目前ISSR標記已廣泛運用于植物種質資源的遺傳多樣性檢測與評價以及基因定位、進化及分子生態學等方面的研究[13]。目前關于荊芥種質資源遺傳多樣性方面的研究比較少，劉紅彬等[14]曾研究了基于ITS序列的不同產地裂葉荊芥系統發育；本實驗室利用RAPD分子標記技術、AFLP技術和ITS序列分析技術對不同產地的荊芥進行過遺傳多樣性分析[15-16]。高峰[17]利用ISSR技術對不同產地荊芥進行過遺傳多樣性分析，而他選用的引物僅為12條，選擇的荊芥材料分布也較集中。鑒于此，本研究擬利用ISSR標記技術，選用100條引物，對供試11份荊芥種質進行分析，旨在研究荊芥種質資源的遺傳多樣性，為進一步篩選和保存荊芥優質種源奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

11種荊芥材料名稱及來源見表1。供試的荊芥種子來自河北、安徽等省，3號和4號材料由北京同仁堂河北中藥材有限公司提供，其他由課題組成員購自當地中藥材市場。其中1號和3號為春播品種，其他均為夏播品種。春播品種于3～4月播種，夏播品種于6～7月播種。

表1供試荊芥材料編號及來源

Table1Samples number and origin of testedSchizonepetatenuifoliaBriq. materials

樣品編號SamplesNumber來源Origin1河北安國Anguo,HebeiProvince2河北安國Anguo,HebeiProvince3河北玉田Yutian,HebeiProvince4河北玉田Yutian,HebeiProvince5安徽亳州Bozhou,AnhuiProvince6浙江蕭山Xiaoshan,ZhejiangProvince7山西運城Yuncheng,ShanxiProvince8甘肅酒泉Jiuquan,GansuProvince9新疆和田Hetian,XinjiangProvince10江蘇鹽城Yancheng,JiangsuProvince11四川容縣Rongxian,SichuanProvince

1.2　試劑和儀器

1.2.1試劑

β-巰基乙醇、異丙醇、氯仿、無水乙醇、TE緩沖液和雙蒸餾水，以上試劑均購自上海生工，為分析純。ISSR-PCR擴增所用的TaqDNA聚合酶 購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2.2儀器

提取DNA的CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。ISSR-PCR擴增在Biometra公司的PCR儀上進行，電泳結果在Bio-Rad儀上拍照，記錄電泳結果。

1.3　方法

1.3.1DNA的提取

DNA的提取參照CTAB基因組DNA快速提取的方法進行[18]。

1.3.2ISSR-PCR體系正交試驗設計

參考王躍虎等[19]優化的荊芥ISSR-PCR反應體系，對DNA模板用量、引物用量、Taq酶的用量進行3因素4水平優化(表2)[20]。

利用L16(43)正交實驗設計[21]，隨機選用1號、6號、9號荊芥材料，用引物UBC855進行擴增。ISSR-PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[22]。

表2ISSR-PCR反應體系體系設計

Table2Design of ISSR-PCR

項目Substance參數設計Reactionparameter模板DNATemplateDNA/ng50100150200引物Primer/(μmol·L-1)0.250.500.751.00TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase/U0.500.751.001.25

1.3.3ISSR-PCR產物的瓊脂糖凝膠檢測

ISSR-PCR反應結束后，取擴增產物6 μL，3 μL loading buffer溶液染色后，在含有EB的1.8%瓊脂糖凝膠中檢測，電壓為5 V·cm-1，最后于凝膠成像系統拍照并記錄結果。

1.3.4ISSR引物退火溫度的篩選

100條ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的ISSR引物序列設計，由北京睿博興科生物技術有限公司合成。在比引物Tm值低3 ℃的基礎上，設置5～6個退火溫度梯度[23-24]。選用1號材料在已經優化的反應體系和擴增程序下對每一個引物進行退火溫度的篩選。

1.3.5ISSR擴增并檢測

用100條引物對11種荊芥進行ISSR分析，然后用濃度為1.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4　數據整理及分析

統計結果，同一引物、同一位點有擴增條帶的記為“1”，無擴增條帶的則記為“0”[25]。利用統計分析軟件DPS(V7.5)計算遺傳距離，UPGMA方法進行聚類分析[26]。

2　結果與分析

2.1　DNA提取

將提取出來的11種荊芥基因組DNA進行5 V·cm-1電壓下電泳45 min，凝膠成像系統拍照并記錄，結果如圖1所示。可以看到提取的11種樣品的條帶都十分清晰，總DNA電泳位置近乎一致，證明提取的基因組DNA純度可靠。

M，DNA分子量標記。下同。M， DNA marker. The same as below.圖1　荊芥11種品種的DNA電泳結果Fig.1　Electrophoresis results of 11 Schizonepeta tenuifolia Briq.

2.2　ISSR-PCR體系正交優化

隨機選用1號，6號，9號材料，UBC855引物進行正交優化，從1號材料的擴增結果(圖2)中可看出，第3、4、6、7、11、12、13、14、15組的擴增條帶多、清晰、整齊；從6號材料的擴增結果(圖3)中可看出，第3組和第4組的擴增條帶較清晰整齊；從9號材料的擴增結果(圖4)中可看出，第3組和第8組的擴增條帶較多，且清晰、整齊，綜合考慮試驗結果的準確性和節省DNA模板，因此選用3號體系為11種荊芥ISSR-PCR試驗的最優體系，最優反應體系為：模板DNA 50 ng，引物0.75 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶1 U，ddH2O 補充至25 μL。

圖2　引物UBC855對1號荊芥的ISSR結果Fig.2　ISSR amplification results for primer UBC855 to No.1 Schizonepeta tenuifolia Briq.

圖3　引物UBC855對6號荊芥的ISSR結果Fig.3　ISSR amplification results for primer UBC855 to No.6 Schizonepeta tenuifolia Briq.

圖4　引物UBC855對9號荊芥的ISSR結果Fig.4　ISSR amplification results for primer UBC855 to No.9 Schizonepeta tenuifolia Briq.

2.3　ISSR引物退火溫度篩選

選用1號材料對每一個引物進行退火溫度的篩選，篩選結果如表3。圖5為引物UBC853、UBC855、UBC858(從右至左)的溫度篩選結果。

2.4　ISSR引物對11種荊芥的擴增

用55條引物在11種荊芥材料中總共擴增出458個條帶，其中多態性帶為246條，多態性比率為53.71%，平均每個引物擴增出8.3個多態

性條帶，擴增條帶最多的是引物UBC809和引物UBC824，擴增條帶為13，多態性條帶分別為6、11，擴增條帶最少的為UBC895，擴增條帶為1，多態性條帶為1。ISSR引物及其擴增產物的多態性水平如表4所示。

2.5　11種荊芥材料的遺傳距離分析

利用55個ISSR引物在11份荊芥材料中所得的458條擴增帶，根據結果計算材料間的遺傳距離[27]，不同荊芥種質資源基于ISSR的遺傳距離結果見表5，結果表明，供試的11個荊芥樣本間的遺傳距離在0.208 3～0.709 1，表明這些荊芥樣本之間的遺傳距離較近，親緣關系差別不大。其中來自安國的荊芥春播和秋播遺傳距離較近為0.287 4，來自玉田的荊芥秋播和春播遺傳距離最近為0.208 3，說明來自同一地區遺傳距離較近。而6號和10號荊芥材料的親緣關系最遠，遺傳距離為0.709 1；其次為8號和10號荊芥材料，遺傳距離為0.647 1；親緣關系最近的是3號和4號荊芥材料，遺傳距離為0.208 3，其次為1號和2號荊芥材料，遺傳距離為0.287 4。

表3實驗所用的55條引物的序列及退火溫度

Table3Sequence and annealing temperatures of fifty-five primers

編號No.序列Sequence(5’-3’)退火溫度Annealingtemperature/℃編號No.序列Sequence(5’-3’)退火溫度Annealingtempera-ture/℃UBC-808(AG)8C53.8UBC-844(CT)8RC49.6UBC-809(AG)8G58.0UBC-845(CT)8RG48.0UBC-810(GA)8T56.0UBC-846(CA)8RT54.0UBC-811(GA)8C54.0UBC-847(CA)8RC53.1UBC-812(GA)8A52.0UBC-848(CA)8RG53.8UBC-813(CT)8T49.0UBC-849(GT)8YA54.0UBC-815(CT)8G52.0UBC-850(GT)8YC54.0UBC-816(CA)8T53.9UBC-851(GT)8YG58.0UBC-817(CA)8A55.0UBC-852(TC)8RA44.9UBC-818(CA)8G49.6UBC-853(TC)8RT54.0UBC-819(GT)8A58.0UBC-854(TC)8RG49.0UBC-820(GT)8C53.1UBC-855(AC)8YT50.0UBC-821(GT)8T58.0UBC-857(AC)8YG44.0UBC-822(TC)8A53.1UBC-858(TG)8RG54.0UBC-824(TC)8G46.0UBC-859(TG)8RC52.0UBC-825(AC)8T53.1UBC-860(TG)8RA45.0UBC-826(AC)8C53.1UBC-861(ACC)558.0UBC-827(AC)8G58.0UBC-862(AGC)558.0UBC-828(TG)8A52.0UBC-864(ATG)544.0UBC-829(TG)8C48.0UBC-866(CTC)554.0UBC-830(TG)8G50.0UBC-868(GAA)544.0UBC-834(AG)8YT54.0UBC-869(GTT)538.0UBC-835(AG)8YC50.8UBC-873(GACA)447.0UBC-836(AG)8YA56.0UBC-880(GGAGA)349.0UBC-840(GA)8YT53.8UBC-890VHV(GT)753.0UBC-841(GA)8YC52.6UBC-891HVH(TG)753.0UBC-842(GA)8YG52.0UBC-895AGAGTTGGTACGTCTT-GATC48.0

從右至左，分別為6個溫度依次為46、48、50、52、54、56℃的UBC853處理； 6個溫度依次為46、48、50、52、54、56℃的UBC855處理； 5個溫度依次為48、50、52、54、56℃的UBC858處理。From right to left， the former six bands were the UBC853 treatments under the temperatures of 46， 48， 50， 52， 54， 56 ℃， respectively. The six bands in the middle were the UBC855 treatments under the temperatures of 46， 48， 50， 52， 54， 56 ℃. The last five bands were the UBC858 treatments under the temperatures of 48， 50， 52， 54， 56 ℃， respectively.圖5　引物UBC853、UBC855、UBC858的退火溫度篩選結果Fig.5　Annealing temperatures screening results for primer UBC853， UBC855 and UBC858

2.6　基于ISSR引物對11種荊芥的聚類分析

用UPGMA方法對55條ISSR引物的擴增結果進行聚類分析，結果如圖6所示。從圖中可看出，親緣關系較近的中聚類時距離較近[28-29]。11種荊芥材料都聚在遺傳距離為0.20～0.56的類群中。在遺傳距離為0.50處，可將供試的11種荊芥材料分為2大類，第一大類包括2號荊芥；第二大類包括1號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、10號、11號荊芥，其中8號和9號荊芥材料的親緣關系比較近，10號和11號荊芥材料的親緣關系比較近。在遺傳距離為0.40處，可將供試的11種荊芥材料分為五大類，第一類為3號、10號和11號荊芥材料，其中10號和11號材料的親緣關系比較近；第二大類為1號、8號和9號荊芥材料，其中8號和9號材料的親緣關系比較近；第三大類為5號、6號和7號荊芥材料，其中5號和7號的親緣關系比較近；第四大類為4號荊芥材料；第五大類為2號荊芥材料。

表4ISSR引物及其擴增產物的多態性水平

Table4Primers of ISSR and polymorphism level of their amplification products

引物編號No.擴增條帶數Amplifiedbands多態性條帶數Polymorphicbands多態性比率Polymorphicpercentage/%引物編號No.擴增條帶數Amplifiedbands多態性條帶數Polymorphicbands多態性比率Polymorphicpercentage/%UBC-8089333.33UBC-84411872.73UBC-80913646.15UBC-8457228.57UBC-8109444.44UBC-84610770.00UBC-81112650.00UBC-84710440.00UBC-81210440.00UBC-8489888.89UBC-8136466.67UBC-8496350.00UBC-814111090.91UBC-8501010100.00UBC-8156466.67UBC-85110770.00UBC-8167457.14UBC-8525360.00UBC-8176466.67UBC-8537342.86UBC-8188562.50UBC-85488100.00UBC-81933100.00UBC-8559555.56UBC-8209444.44UBC-85777100.00UBC-82110770.00UBC-8586233.33UBC-82210440.00UBC-8599666.67UBC-824131184.62UBC-8607685.71UBC-8256116.67UBC-86110550.00UBC-8267228.57UBC-8627457.14UBC-8279666.67UBC-8649111.11UBC-8288450.00UBC-8668112.50UBC-8296233.33UBC-86812325.00UBC-8309777.78UBC-8694250.00UBC-8349333.33UBC-87312758.33UBC-8357457.14UBC-88012325.00UBC-8369444.44UBC-8906350.00UBC-84010330.00UBC-8917228.57UBC-8418112.50UBC-89511100.00UBC-8429555.56總數Intotal45824653.71

表511個供試材料基于ISSR的遺傳距離

Table5Euclidean distance among 11 materials based on ISSR analysis

材料Material1234567891020.287430.49500.322940.46150.35920.208350.48000.42160.43810.361960.60780.51960.49020.47170.378970.44660.43520.46430.37840.37740.396080.51610.41940.50000.50940.42110.54170.420090.40450.32220.50490.45710.49020.60190.47170.4270100.52630.51000.57940.53210.60550.70910.51850.64710.5208110.49020.35350.37250.31070.43400.58180.44640.53850.45540.4286

圖6　11個供試材料基于ISSR的聚類圖Fig.6　Dendrogram of 11 materials tested based on ISSR

3　討論

對遺傳背景、遺傳結構和種質資源的遺傳關系進行研究，可為提供優良品種的選育提供幫助[30]。因此，一個或更多的可靠的分子鑒定方法是必要的。ISSR多態性較豐富，能進行種質資源和遺傳多樣性的分析。本實驗通過ISSR-PCR用55個ISSR引物擴增11個市場流通的南北荊芥樣本，結果顯示多態性比率為53.71%，這表明荊芥遺傳多樣性受到了一定的破壞。其中一些樣本的種質資源不同，但遺傳距離在0.208 3～0.709 1，表明其遺傳關系密切，表明ISSR可以對具有較近遺傳距離的個體進行相對較高的多態性檢測，并檢測到具有遠親緣關系的種質資源，表明ISSR技術可用于具有遠遺傳距離的種質資源。本研究中，發現3號河北玉田和4號河北玉田荊芥材料親緣關系最近，其次為1號和2號河北安國荊芥材料；浙江蕭山和江蘇省荊芥材料的親緣關系最遠；其次為甘肅省和江蘇省荊芥材料；但聚類結果中來自河北、安徽亳州、浙江蕭山、山西、甘肅、新疆、江蘇、四川省等地的荊芥種質資源，雖南北各異，卻聚類在了一起，這就表明有可能全國各地種質資源引種頻繁，不同地域引種混亂，導致各省的荊芥親緣關系較近，品種混雜，缺乏一定的規范與標準，應當大力加強荊芥種質資源的保護。

高峰[17]對不同產地荊芥利用ISSR技術進行遺傳多樣性分析，發現裂葉荊芥的遺傳多樣性為50.93%，低于同科中廣藿香的種內遺傳多樣性，兩者比較表明裂葉荊芥的遺傳多樣性已經受到了一定程度的破壞，應當加強種質資源的保護，與本研究結果較一致。馬艷芝[16]采用AFLP標記和ITS序列分析研究不同荊芥種質資源，發現荊芥AFLP標記多態性不高(63.90%)，聚類結果中親緣關系較近或引種頻繁地區較近種質資源聚類在一起，與本研究結果較一致。本研究發現，雖1號和2號荊芥材料，3號和4號荊芥材料的遺傳距離較近，但在聚類時卻沒有首先聚在一起，可能是由于長期大面積連年種植，不科學引種等各種原因，導致群體混雜、種質退化，從而影響了荊芥藥材的整齊度和品質。而來自南北各地的荊芥種質資源卻聚類在了一起，這就表明有可能全國各地種質資源引種頻繁，導致各省的荊芥親緣關系較近。

另外馬艷芝等[15]還采用RAPD技術對不同產地的荊芥種質資源進行分析，發現11種荊芥材料的遺傳距離在0.133 3～0.777 8，種質資源遺傳差距不大，遺傳多樣性不高，與本研究的結果基本一致。本研究基于ISSR分析技術，發現11種荊芥遺傳距離在0.208 3～0.709 1，但聚類結果與材料來源地的遠近距離的分類結果并不是完全一致的，在一定程度上有相關性，這有可能是各地荊芥引種頻繁、不同地域引種混亂導致的，應大力加強荊芥種質資源的保護。

參考文獻(References)：

[1]吳婷，丁安偉，張麗.荊芥現代研究概況[J].江蘇中醫藥，2004，25(10):64-67.

WU T， DING A W， ZHANG L.Modern studies ofSchizonepetatenuifoliaBriq.[J].JiangsuJournalofTraditionalChineseMedicine，2004，25(10):64-67.(in Chinese)

[2]胡丹丹，黃山，李斌，等.藏荊芥與荊芥的揮發性成分比較[J].中成藥，2016，38(5):1078-1082.

HU D D，HUANG S，LI B，et al. Comparison of volatile contituents inNepetaangustifoliaandSchizonepetatenuifalia[J].ChineseTraditionalPatentMedicine，2016，38(5):1078-1082.(in Chinese with English abstract)

[3]中華人民共和國衛生部藥典委員會編.中華人民共和國藥典一部[M].北京:人民衛生出版社，2015：232.

[4]趙立子，魏建和.中藥荊芥最新研究進展[J].中國農學通報，2013，29(4):39-43.

ZHAO L Z， WEI J H. Latest research and development ofSchizonepetatenuifoliaBriq[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin，2013，29(4):39-43. (in Chinese with English abstract)

[5]韓春梅.荊芥高產栽培技術[J].四川農業科技，2011(6):29.

HAN C M. High yield cultivation techniques ofSchizonepetatenuifoliaBriq.[J].ScienceandTechnologyofSichuanAgriculture，2011(6):29. (in Chinese)

[6]吳疆，劉曉武.荊芥大田栽培技術[J].農業科技與信息，2008 (5):46.

WU J， LIU X W. Field cultivation technology ofSchizonepetatenuifoliaBriq.[J].InformationofAgriculturalScienceandTechnology， 2008 (5):46. (in Chinese)

[7]丁軍章，李春艷.藥用植物荊芥規范化生產栽培技術[J].現代農業，2013(8):7-8.

DING J Z， LI C Y. The production of medicinal plant cultivation techniques ofSchizonepetastandardization[J].SpecificationofModernAgriculturalProduction， 2013(8): 7-8. (in Chinese)

[8]周麗娜.荊芥的化學成分及藥理作用研究[J].中華中醫藥學刊，2004，22(10):1935.

ZHOU L N.Study on chemical constituents and pharmacological effects ofSchizonepetatenuifoliaBriq.[J].ChineseArchivesofTraditionalChineseMedicine， 2004，22 (10): 1935. (in Chinese with English abstract)

[9]何婷，湯奇，曾南，等.荊芥揮發油及其主要成分抗流感病毒作用與機制研究[J].中國中藥雜志，2013，38(11):1772-1777.

HE T，TANG Q，ZENG N，et al. Study on effect and mechanism of volatile oil ofSchizonepetaeherbaand its essential components against influenza virus[J].ChinaJournaloftraditionalChineseMedicine， 2013， 38(11): 1772-1777. (in Chinese with English abstract)

[10]張改先.荊芥穗的化學成分、藥理作用及臨床應用[J].山西職工醫學院學報，2011，21(1):57-58.

ZHANG G X.The chemical composition， pharmacological effects and clinical application ofSchizonepetatenuifoliaBriq.[J].JournalofShanxiMedicalCollegeforContinuingEducation， 2011， 21(1): 57-58. (in Chinese with English abstract)

[11]文苗苗，李桂雙，張龍進，等.黃芩種質資源ISSR遺傳多樣性的分析及評價[J].植物研究，2012，32(1):32-37.

WEN M M，LI G S，ZHANG L J，et al. Analysis and evaluation on genetic diversity ofScutellariabaicalensisG. by ISSR markers[J].BulletinofBotanicalResearch，2012，32(1):32-37. (in Chinese with English abstract)

[12]馬艷芝，客紹英.不同柴胡種質資源的ISSR和ITS序列分析[J].西北農林科技大學學報(自然科學版)，2015，43(1):193-200.

MA Y Z，KE S Y. ISSR-PCR and ITS sequence analysis ofBupleurumgermplasm resources[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition)，2015，43(1):193-200. (in Chinese with English abstract)

[13]盧家仕，卜朝陽，呂維莉，等.不同產地石斛屬種質資源的ISSR遺傳多樣性分析[J].中草藥，2013，44(1):96-100.

LU J S， BU Z Y， LYU W L，et al. ISSR analysis on genetic diversity of germplasms resources inDendrobiumSW.from different habitats[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs，2013，44(1):96-100. (in Chinese with English abstract)

[14]劉紅彬，顧小龍，張海紅，等.基于ITS序列的不同產地裂葉荊芥系統發育分析[J].植物遺傳資源學報， 2012，13(6):1073-1077.

LIU H B， GU X L，ZHNAG H H， et al. Phylogenetic analysis ofSchizonepetatenuifoliafrom different producing areas based on ITS sequences[J].JournalofPlantGeneticResources， 2012， 13(6): 1073-1077. (in Chinese with English abstract)

[15]馬艷芝，陳桂平.11種荊芥種質資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].中藥材，2017，40(2):311-314.

MA Y Z， CHEN G P. Analysis of genetic diversity in eleven varieties ofSchizonepetatenuifaliaby RAPD[J].JournalofChineseMedicinalMaterials，2017，40(2):311-314. (in Chinese with English abstract)

[16]馬艷芝.不同荊芥種質資源的AFLP標記和ITS序列分析[J].西北農林科技大學學報，2017，45(6):228-234.

MA Y Z.Diversity ofSchizonepetatenuifoliaBriq.based on AFLP and ITS sequence analysis[J].JournalofNorthwestA&FUniversity，2017，45(6):228-234. (in Chinese with English abstract)

[17]高峰.荊芥種質資源評價和種子質量標準研究[D].北京:中國中醫科學院，2007.

GAO F. Research on the evaluation criteria and seed quality ofSchizonepetatenuifoliaBriq. germplasm resources[D]. Beijing: Chinese Academy of traditional Chinese Medicine， 2007. (in Chinese with English abstract)

[18]張璐璐，樊晨，樊哲，等.改良CTAB法提取草莓基因組DNA[J].現代園藝，2014(11):5-7.

ZHANG L L，FAN C，FAN Z，et al. Improved CTAB extraction of strawberry genome DNA[J].ModernHorticulture， 2014(11): 5-7. (in Chinese)

[19]王躍虎，魏建和，張東向，等.利用Taguchi方法優化荊芥ISSR-PCR反應體系[J].分子植物育種，2007，5(增刊1):177-181.

WANG Y H，WEI J H，ZHNAG D X， et al. Optimization for ISSR-PCR system ofSchizonepetatenuifoliaBriq using Taguchi methods[J].MolecularPlantBreeding，2007，5(S1):177-181. (in Chinese with English abstract)

[20]楊曉霞，鄭健，冷平生，等.暴馬丁香ISSR-PCR反應體系優化及引物篩選[J].分子植物育種，2014，12(5):1018-1026.

YANG X X，ZHENG J，LENG P S，et al.Optimization of ISSR-PCR reaction system and primer selection forSyringareticulatevar.amurensis[J].MolecularPlantBreeding，2014，12(5):1018-1026. (in Chinese with English abstract)

[21]任風鳴，胡開治，劉燕琴，等.傳統中藥金錢草ISSR-PCR反應體系的正交優化研究[J].中國中藥雜志，2014，39(12):2233-2238.

REN F M，HU K Z，LIU Y Q， et al. Optimization for ISSR-PCR system of traditional Chinese medicineLysimachiachristinaeby orthogonal design[J].ChineseJournalofTraditionalChineseMedicine， 2014， 39(12): 2233-2238. (in Chinese with English abstract)

[22]張娜，李群，高興旺，等.葡萄ISSR-PCR反應體系的建立與正交優化[J].江蘇農業科學，2016，44(9):47-50.

ZHNAG N，LI Q，GAO X W，et al.Establishment and orthogonal optimization of ISSR-PCR reaction system in grape[J].JiangsuAgriculturalSciences， 2016，44 (9): 47-50. (in Chinese with English abstract)

[23]黃樹軍，黃婷，肖永泰，等.大明竹屬部分植物ISSR-PCR反應體系優化及有效引物篩選[J].福建農林大學學報(自然科學版)，2013，42(6):616-622.

HUANG S J，HUANG T，XIAO Y T，et al. Optimization of ISSR-PCR reaction system and selection of effective primers for ISSR marker in some species ofPleioblastus[J].JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition)，2013，42(6):616-622. (in Chinese with English abstract)

[24]李志華，蔣興川，桂福榮，等.西花薊馬ISSR-PCR多態性引物及其退火溫度篩選[J].貴州農業科學，2013，41(4):1-6.

LI Z H，JIANG X C，GUI F R， et al. Screening of ISSR-PCR polymorphism primers and their annealing temperature inFrankliniellaoccidentalis[J].GuizhouAgriculturalScience，2013，41(4):1-6. (in Chinese with English abstract)

[25]劉歡，慕平，趙桂琴.燕麥種質資源遺傳多樣性ISSR研究[J].草業學報，2012， 21(4):116-124.

LIU H， MU P， ZHAO G Q. A study on genetic diversity ofAvenagermplasm resources detected by ISSR[J].JournalofGrasslandScience， 2012， 21 (4): 116-124. (in Chinese with English abstract)

[26]李宗艷，秦艷玲，蒙進芳，等.西南牡丹品種起源的ISSR研究[J].中國農業科學，2015，48(5):931-940.

LI Z Y，QIN Y L，MENG J F，et al. Study on the origin of tree peony cultivars from Southwest China based on ISSR technology[J].ScientiaAgriculturaSinica， 2015， 48(5):931-940. (in Chinese with English abstract)

[27]魏曉雨，田義新，趙智靈，等.不同產地西洋參種質遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析[J].中草藥，2014，45(21):3135-3158.

WEI X Y，TIAN Y X，ZHAO Z L，et al. RAPD and ISSR analysis of genetic diversity of American ginseng germplasm from different habitats[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs，2014，45(21):3135-3158.(in Chinese with English abstract)

[28]姜艷，劉進平.海南胡椒屬植物資源形態多樣性聚類分析[J].熱帶農業科學，2011，31(3):1-7.

JIANG Y， LIU J P. Cluster analysis of morphological diversity ofPiperspp. in Hainan[J].ChineseJournalofTropicalAgriculture，2011，31(3):1-7. (in Chinese with English abstract)

[29]王佳，徐強，繆旻珉，等.黃瓜種質資源遺傳多樣性ISSR分析[J].分子植物育種，2007，5(5):677-682.

WANG J， XU Q， MIAO M M， et al. Analysis of genetic relationships of cucumber(CucumissativusL.) germplasm by ISSR markers[J].MolecularPlantBreeding，2007，5(5):677-682. (in Chinese with English abstract)

[30]韋榮昌， 白隆華. 羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株遺傳背景的ISSR分析[J].中草藥，2015， 46(6):881-886.

WEI R C， BAI L H. ISSR analysis of genetic background of triploid female and diploid male ofSiraitiagrosvenorii[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs， 2015， 46(6):881-886. (in Chinese with English abstract)